Untersuchungen zur Entstehung chromosomaler Translokationen nach ionisierender Bestrahlung

Für den Erhalt der genomischen Stabilität ist die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) von besonderer Relevanz. Werden DSBs inkorrekt repariert, können daraus chromosomale Aberrationen resultieren, wie z. B. Translokationen. Translokationen entstehen durch die Verbindung falscher DNA-Enden während der DSB-Reparatur. Verschiedene Studien beschreiben das Auftreten von Translokationen in malignen Tumoren und postulieren folglich eine Korrelation zwischen Translokationen und einer Karzinogenese. Daher ist das Verständnis der DSB-Reparaturmechanismen, die eine Translokationsentstehung begünstigen, von großer Bedeutung im Bereich der Onkologie. Die wichtigsten Mechanismen für die Reparatur von DSBs sind die kanonische nicht-homologe Endverknüpfung (canonical non-homologous end-joining, c-NHEJ) und die homologe Rekombination (HR). DSBs können in allen Zellzyklusphasen über das NHEJ repariert werden, wobei neben dem c-NHEJ die Funktion eines alternativen (alt-) NHEJ innerhalb der DSB-Reparatur diskutiert wird. Die HR-vermittelte DSB-Reparatur ist dagegen auf die S- und G2-Phase beschränkt, da für die Reparatur die homologe Schwesterchromatide als Matrize benötigt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Reparatur strahleninduzierter DSBs und die Entstehung von Translokationen in humanen G1-Phase-Zellen mittels Chromosomenstudien untersucht. Neben der Analyse von chromosomalen Brüchen, die einen Aufschluss über die Quantität der DSB-Reparatur erlaubt, sollte die Auswertung von chromosomalen Translokationen einen Einblick in die Qualität der DSB-Reparatur ermöglichen und das Verständnis für die Entstehung von Translokationen erweitern. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die vorzeitige Chromosomenkondensation (premature chromosome condensation, PCC) über die Methode der Polyethylen-vermittelten Zellfusion in G1-Phase-Zellen etabliert. Anschließend wurde die PCC-Methode mit der 3-Farben-FISH-Technik kombiniert, wodurch eine Analyse chromosomaler Brüche und chromosomaler Translokationen in der G1-Phase möglich wurde. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Reparatur chromosomaler Brüche und die Entstehung chromosomaler Translokationen in Wildtyp (WT)-Zellen im Vergleich zu reparaturdefizienten Zellen analysiert. In G1-WT-Zellen zeigten die Reparatur chromosomaler Brüche und die Ausbildung von Translokationen eine schnelle und eine langsame Komponente. Obwohl die Mehrheit der Chromosomenbrüche (ca. 80 %) mit schneller Kinetik repariert wird, entstehen über die langsame Reparatur der verbleibenden 20 % der Chromosomenbrüche etwa 50 % aller detektierten Translokationen. Folglich konnte in der vorliegenden Arbeit eine vermehrte Fehlerhaftigkeit der langsamen Reparaturkomponente in G1-WT-Zellen nachgewiesen werden. In weiteren Chromosomenanalysen wurde gezeigt, dass die Qualität der langsamen DSB-Reparatur in Abhängigkeit des DNA-Resektion vermittelnden Proteins CtIP steht. Darüber hinaus wurde ein Einfluss der Proteinkinase Plk3 auf die Translokationsentstehung innerhalb der langsamen Reparaturkomponente detektiert. Andere Studien konnten eine Abhängigkeit zwischen einer Plk3-induzierten Phosphorylierung von CtIP und einer DSB-Resektion in der G1-Phase nachweisen. In folgenden Chromosomenanalysen wurde der CtIP- und Plk3-abhängige Reparaturweg weiter klassifiziert und der Einfluss der alt-NHEJ Proteine PARP1 sowie Lig1/3 auf die DSB-Reparatur untersucht. Hierbei konnte keine Beteiligung des alt-NHEJ innerhalb der DSB-Reparatur bzw. der Translokationsentstehung in G1-WT-Zellen detektiert werden. Die Analyse von XLF- und Lig4-defekten c-NHEJ-Mutanten zeigte zwar eine quantitativ und qualitativ verschlechterte Reparatur, aber ebenfalls keinen Einfluss des alt-NHEJ. Darüber hinaus konnte eine Abhängigkeit der langsamen DSB-Reparatur von der c-NHEJ-Kernkomponente DNA-PK und der Nuklease Artemis gezeigt werden. Folglich postulieren die Studien der vorliegenden Arbeit, dass die Reparatur von DSBs in G1-WT-Zellen ausschließlich über das c-NHEJ erfolgt, wobei die Entstehung von Translokationen innerhalb der langsamen Reparaturkomponente anscheinend in Abhängigkeit einer DSB-Resektion verläuft. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Grundlage der Translokationsentstehung innerhalb der schnellen DSB-Reparaturkomponente untersucht. Frühere Studien beschreiben das Auftreten von Translokationen in transkriptionell aktiven Bereichen. Daher wurde die chromosomale Reparatur in Abhängigkeit der DNA-Transkription betrachtet. Nach BAF180-Depletion konnte gezeigt werden, dass ein fehlerhaftes Chromatinremodelling die Quantität der schnellen DSB-Reparaturkomponente verlangsamt, allerdings im weiteren Verlauf quantitativ und qualitativ nicht beeinflusst. Nach Inhibition der RNA-Polymerase II konnte keine Veränderung der Reparatur-Quantität sowie der Qualität der schnellen Reparaturkomponente beobachtet werden. Überraschenderweise wurde innerhalb der langsamen Reparaturkomponente eine Abhängigkeit der Reparatur-Qualität von der Transkription detektiert. Zusammenfassend postulieren die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass neben der DNA-Resektion auch die DNA-Transkription entscheidend ist für die Ausbildung von Translokationen während der langsamen DSB-Reparatur in der G1-Phase. Hierbei könnte der Einfluss der Transkription auf die langsame DSB-Reparatur durch eine schadensabhängige Synthese von reparaturrelevanten Proteinen oder durch andere transkriptionsinduzierte Prozesse, wie z. B. eine veränderte Chromatindynamik, begründet sein. In weiterführenden Untersuchungen könnten diese Aspekte verifiziert werden