Über die Etablierung neuartiger Verfahren zur DNA vermittelten in vitro Genotyp-Phänotyp-Kopplung

In dieser Arbeit sollte ein neuartiges Verfahren zur Genotyp-Phänotyp-Kopplung etabliert werden, bei dem das zu präsentierende Polypeptid direkt oder über Microbeads mit dem kodierenden DNA Molekül verknüpft ist. Dies wurde unter Verwendung der HaloTag® Technologie erfolgreich umgesetzt, wobei sich die direkte Verknüpfung von Polypeptid und kodierendem DNA Molekül als zielführend erwies. Bei dem als HaloTag®-DNA-display bezeichneten Verfahren wird zunächst eine HaloLink® Bindungsgruppe über modifizierte PCR Primer in die Matrizen DNA eingebaut, welche für ein Fusionsprotein aus dem HaloTag®-Bindeprotein und dem zu präsentierenden Peptid kodiert. Nach Expression können die neusynthetisierten HaloTag®-Fusionsproteine die Bindungsgruppe der DNA-Matrize binden, wodurch kovalente DNA-Protein-Komplexe entstehen. Die Ausbildung dieser DNA-Protein-Komplexe konnte durch Mischen zweier unterschiedlicher Komplexe und Affinitätsselektion einer der Varianten nachgewiesen werden. In einem weiteren Mischungsexperiment konnte durch die Anreicherung eines Genotyps, aus einem Gemisch zweier Genotyp Varianten, eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung, also die Kopplung des Fusionsproteins mit dem kodierenden DNA Molekül nachgewiesen werden. Hierzu wurden die DNA-Matrizen Moleküle in Wasser-in-Öl-Emulsion exprimiert, wobei die Konzentration an DNA-Matrize so gewählt wurde, dass statistisch nur ein DNA-Molekül pro Kompartiment vorliegt. Weiter konnte eine vollrandomisierte Peptidbibliothek erstellt werden, die in Modellexperimenten zur Anreicherung von Zielprotein bindenden Peptidsequenzen eingesetzt wurde. Hierbei wurden vier bis fünf aufeinanderfolgende Selektionsrunden auf Bindung eines immobilisierten Zielproteins durchgeführt und einzelne Variante im Anschluss analysiert. Durch diese Experimente konnte die Praxistauglichkeit des HaloTag®-DNA-displays bestätigt werden