Synthetische RNA-Schalter zur Regulation zellulärer Prozesse

Ziel dieser Arbeit war es, Strategien zur Etablierung synthetischer, RNA basierter Genschalter zu entwickeln. In einem Teilprojekt sollte die virale Replikation des RNA-Virus Semliki Forest Virus (SFV) mit einem RNA-Schalter reguliert werden. Hierzu wurde das Tetrazyklin bindende Aptamer in den subgenomischen Promotor inseriert, um bei Ligandbindung mit der Promotorerkennung zu interferieren. In einem weiteren Ansatz wurde das Theophyllin abhängige, selbstspaltende hammerhead Ribozym in die 3‘-UTR eingebracht. Dies sollte ligandabhängig zur Degradation der viralen RNA führen. Als Testsystem wurde ein SFV Replikon verwendet, welches für GFP statt der Strukturproteine codiert. Dadurch konnte die Replikation über die GFP-Expression beobachtet werden. Trotz intensiver Optimierung der Infektions- und Schaltbedingungen konnte mit keinem Konstrukt eine signifikante Regulation erreicht werden. In einem zweiten Projekt sollte das alternative Spleißen mit Hilfe eines TetR bindenden Aptamers kontrolliert werden. Hierzu wurde ein Minigen eingesetzt, welches das Aptamer direkt downstream der 5’-Spleißstelle im Intron enthält. Das Aptamer kontrolliert dadurch ligandabhängig den Zugang zur Spleißstelle. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Expression von TetR der Spleißprozess behindert wurde. Die Zugabe von Doxycyclin, welches in TetR eine Konformationsänderung induziert und die Bindung an das Aptamer inhibiert, ermöglichte das Spleißen wieder. Es wurden verschieden starke 5‘- und 3‘-Spleißstellen sowie unterschiedlich stabile Aptamere getestet. Eine starke Spleißstelle und ein destabilisiertes Aptamer bewirkten die stärkste Regulation. Zusätzlich wurde das Aptamer auch in einem anderen Minigen erfolgreich getestet. Das System wurde daraufhin in den Kontext einer mRNA überführt. Hierzu wurden die besten Intron-Aptamer-Kombinationen aus dem Minigen an verschiedenen Stellen in das Luziferasegen inseriert. Der stärkste Regulationsfaktor lag bei 1,7. Das zeigt, dass die im Minigen erhobenen Daten nicht direkt auf einen mRNA-Kontext übertragbar sind und an den neuen Kontext angepasst werden müssen. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde der Rec-RcRE-Komplex des humanen endogenen Retrovirus HERV-K untersucht, welcher für den Export gespleißter und ungespleißter viraler RNA notwendig ist. Es konnte gezeigt werden, dass purinreiche Motive (GGAA-, GGA- und AAGG-Motiv) an der Bindung beteiligt sind. Allerdings war die Dissoziationskonstante der Motive allein 50-fach schlechter als die des gesamten RcRE Elements. Mutationsanalysen und Exportstudien führten zu einem Bindungsmodell, wonach Rec in erster Linie an die zentrale Region der komplex gefalteten Struktur des RcRE pck30 bindet, gefolgt von einer kooperative Bindung an die weniger affinen, purinreichen Bindungsmotive. Vermutlich wird der Exportkomplex aus Rec und dem RcRE durch die Bindung von Rec an die purinreiche Motive stabilisiert