Neue Miniproteininhibitoren gegen die humane Typ II Transmembranserinprotease Matriptase (MT-SPI)

In dieser Arbeit sollten neue Miniproteininhibitoren gegen die humane Typ II Transmembranserinprotease Matriptase (MT-SP1) mittels rationalen Protein Design oder gerichteter Evolution durch die Methode des yeast surface display gefunden werden. Zunächst sollte die Eignung der natürlichen MCoTI Varianten als Inhibitoren der Matriptase untersucht werden. Dazu wurden diese aus den Samen von Momordica cochinchinensis isoliert und die katalytische Domäne rekombinant in E.coli produziert und aufgereinigt. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Inhibitionskonstanten gegen Matriptase. Dabei stellte sich MCoTI-II (Kiapp 235 nM) als geeignetes Miniprotein heraus und wurde in den folgenden Abschnitten als scaffold für neue Inhibitoren verwendet. Anschließend wurden durch rationales Protein Design am Computer verschiedene Positionen im Miniprotein identifiziert und durch Peptidfestphasensynthese neue Aminosäuren an diesen Stellen eingefügt und auf ihre Inhibition gegen Matriptase hin untersucht, um Varianten mit einer niedrigeren Kiapp zu erhalten. Diese Experimente lieferten jedoch keine Varianten des Miniproteins mit verbesserten Inhibitionseigenschaften und lassen diese Methode nur bedingt geeignet erscheinen, neue Proteaseinhibitoren basierend auf oMCoTI-II zu finden. Anschließend wurden zunächst zwei unterschiedliche kombinatorische Bibliotheken auf Basis von oMCoTI-II mit Diversitäten von 1E+7 und 2E+7 in S. cerevisiae erzeugt. Die beiden Bibliotheken wurden im yeast surface display separat gegen Matriptase mittels fluorescence asisted cell sorting (FACS) mehreren Selektionsrunden durchmustert. Dabei wurde stetig die Antigenkonzentration verringert, um auf hochaffine Inhibitoren zu selektieren. In der anschließenden Analyse konnten mehrere Varianten mit unterschiedlichen Aminosäurensequenzen identifiziert werden. Daraus wurden einige Miniproteine ausgewählt, mittels Peptidfestphasensynthese dargestellt und ihre apparenten Inhibitionskonstanten bestimmt. Es konnten zwei Miniproteinvarianten mit hohen Affinitäten und unterschiedlichen Sequenzen gegen Matriptase (Kiapp 3,7 und 8,7 nM) identifiziert werden