Differentielle Proteomanalyse porciner Hirnkapillarendothelzellen

Das cerebrale Kapillarendothel stellt die anatomische Basis für den Stofftransport zwischen Blut und Gehirn dar. Diese als Blut-Hirn-Schranke bezeichnete Barriere schützt das Gehirn vor metabolischen Schwankungen der Blutzusammensetzung und vor dem Eindringen neurotoxischer Substanzen. Gleichzeitig erfolgt über die Blut-Hirn-Schranke der Austausch von Nährstoffen, Ionen und Metaboliten zwischen Blut und Gehirn. Die funktionellen Besonderheiten der Blut-Hirn-Schranke spiegeln sich in der Proteinausstattung der Hirnkapillarendothelzellen - ihrem Proteom - wieder. Zum Verständnis der Schrankenfunktion ist daher die Identifizierung von Proteinen notwendig, die spezifisch in Hirnkapillaren exprimiert werden (differentielle Proteomanalyse). Eine Methode zur Darstellung von Proteomen ist die 2-D Gelelektrophorese. Dabei erfolgt die Separierung in der ersten Dimension durch isoelektrische Fokussierung aufgrund der Ladung der Proteine. Als zweite Dimension schließt sich senkrecht dazu eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese an, welche die Proteine nach ihrem Molekulargewicht trennt. Nach Trennung im 2-D Gel erfolgt die Identifizierung der Proteinspots mit Hilfe der Massenspektrometrie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die differentielle Proteomanalyse porciner Hirnkapillarendothelzellen durchgeführt. Die Zellen wurden aus schlachtfrischen Schweinehirnen präpariert. Die Präparationsschritte wurden dabei optimiert, so dass Zellmaterial mit der für die Proteomanalyse notwendigen hohen Vitalität und Reinheit erhalten wurde. Zum fraktionierenden Aufschluß der Zellen wurde ein Verfahren etabliert, das im wesentlichen aus der sequentiellen Extraktion des Probenmaterials mit verschiedenen detergenzhaltigen Puffern bestand. In den dabei erhaltenen Proteinfraktionen waren cytosolische Proteine, Membranproteine und Kernproteine angereichert. Mittels MALDI-Analyse wurden zunächst 45 Proteine aus der Membranfraktion und 23 Proteine aus der Kernfraktion identifiziert. Für die Detektion von Blut-Hirn-Schranke-spezifischen Proteinen, wurden die Proteinmuster der 2-D Gele aus Hirnkapillarendothelzellen mit denen aus Aortaendothelzellen, die keine Schrankenfunktion besitzen, verglichen. Insgesamt wurden 11 Proteine identifiziert, die in Hirnkapillarendothelzellen nicht aber in Aortaendothelzellen exprimiert werden. 3 der identifizierten Proteine wurden in Hirnkapillarendothelzellen mindestens zweimal stärker exprimiert. Unter den differentiell exprimierten Proteinen war eine bisher nicht beschriebene Isoform der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Kinase a (aCamKII). Das Protein ist neben dem CamKII-assoziierten Protein a-KAP die einzige bisher beschrieben Isoform, die keine Kinaseaktivität aufweist und wird wahrscheinlich gehirnspezifisch exprimiert. Der wesentliche Unterschied zu a-KAP ist das Fehlen einer 11 AS-Sequenz, die ein potentielles Kernlokalisierungssignal enthält. Das Protein spielt vermutlich ebenso wie a-KAP eine Rolle beim intrazellulären Targeting der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Kinase und hätte damit eine indirekte Funktion bei der Weiterleitung zahlreicher extrazellulärer Signale