Aspectos genéticos e bioquímicos da doença de Gaucher com ênfase no gene GBA1 e no metabolismo da vitamina B12

A doença de Gaucher (DG) é uma doença rara, herdada de forma autossômica recessiva, causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glicocerebrosidase (GCase) devido a mutações patogênicas no gene GBA1, o que leva ao acúmulo do substrato glicocerebrosídeo em macrófagos. A DG apresenta uma grande variabilidade fenotípica, sendo caracterizada principalmente por manifestações hematológicas, viscerais, ósseas e neurológicas. Embora cerca de 500 mutações já tenham sido descritas no gene GBA1, não há uma associação estabelecida entre mutações específicas e as características clínicas apresentadas pelos pacientes com DG. O acúmulo de glicocerebrosídeo pode estar afetando a função lisossômica, o que poderia levar a uma disfunção celular e a anormalidades clínicas, como a deficiência de vitamina B12 (B12). Objetivos: Caracterizar o genótipo e o metabolismo da vitamina B12 em pacientes com DG. Métodos: Foram analisados, por Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), 33 pacientes com DG para identificar a presença de deleções e inserções no GBA1 em pacientes que não apresentavam genótipo definido. Foram caracterizadas amostras de 72 pacientes com DG (n=40 da região Sul do Brasil, n=32 de outras regiões do país) utilizando o método de Sanger ou sequenciamento de nova geração e as frequências alélicas das mutações identificadas foram comparadas entre pacientes com DG de diferentes regiões do Brasil. Biomarcadores funcionais do metabolismo da B12 foram mensurados em fibroblastos de indivíduos saudáveis (n=3), pacientes com DG não tratados (tipo I=1; tipo II=1; tipo III=1) e um heterozigoto assintomático. A expressão de transcobalamina (TC) em células de indivíduos saudáveis e de pacientes com DG foi analisada por Western blot. Níveis de B12 total, holo-transcobalamina (holo-TC), homocisteína total (tHcy) e ácido metilmalônico (MMA) foram analisados retrospectivamente em 52 amostras de plasma de 10 pacientes brasileiros com DG tipo I acompanhados pelo Centro de Referência em DG do Sul do Brasil. Resultados: Foi identificada uma deleção em heterozigose de uma região do gene GBA1 em uma paciente com DG que apresentava genótipo incompleto. Trinta e uma mutações foram identificadas em pacientes brasileiros com DG, sendo duas delas não descritas na literatura. Pacientes com DG pertencentes à região Sul do Brasil apresentaram perfil alélico diferente daqueles que pertenciam às demais regiões do país. Níveis de biomarcadores funcionais do status de B12 não diferiram entre amostras de células de pacientes com DG e de indivíduos saudáveis. A análise por Western blot a partir de lisados de células indicou a presença de conteúdo normal de TC em ambas as linhagens celulares. Nenhum paciente com DG tipo I apresentou níveis 10 reduzidos de B12 total em amostras de plasmas. A análise de quatro biomarcadores do status de B12 sugere que não há uma deficiência funcional desse micronutriente em pacientes com DG tipo I. Conclusão: A técnica de MLPA é uma metodologia complementar que pode ser utilizada para analisar a presença de deleções e de inserções em pacientes com DG que não apresentam genótipo definido. Em relação à caracterização genética de pacientes brasileiros com DG, o alelo mais frequente foi o N370S. O estudo sugere que existe um perfil alélico específico no GBA1 entre pacientes com DG de diferentes regiões do Brasil, sendo que os alelos N370S, RecNciI e L444P foram mais representativos na região Sul do país. A investigação do metabolismo da B12 em pacientes com DG mostrou que as vias de transporte e de processamento da B12 estão preservadas em células de pacientes com DG. A análise de biomarcadores do status de B12 em amostras de plasmas mostrou que pacientes brasileiros com DG tipo I apresentam níveis normais de B12, o que difere de um estudo prévio que demonstrou uma alta prevalência de níveis reduzidos de B12 em pacientes com DG da população judeus Ashkenazi. Além disso, a análise de biomarcadores funcionais (tHcy e MMA) não indicou deficiência de B12 em pacientes com DG. Portanto, o acúmulo de glicocerebrosídeo nos lisossomos parece não afetar o processamento e o tráfego da vitamina B12, não ocasionando uma deficiência funcional de B12 em pacientes com DG tipo I.Gaucher disease (GD) is a rare autosomal recessive disease caused by the reduced activity of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase (GCase) due to pathogenic mutations in GBA1 gene, which leads to an accumulation of its substrate, glucocerebroside, in the macrophages. GD presents a considerable phenotypic variation, and it is characterized mainly by hematological, visceral, skeletal and neurological manifestations. Although around 500 mutations have been described in the GBA1, there is no clear association between mutation and clinical features presented by patients with GD. The accumulation of glucocerebroside may be affecting the lysosomal function and leads to cellular dysfunction and clinical abnormalities, such as a vitamin B12 deficiency. Objectives: To characterize the genotype and vitamin B12 metabolism in GD patients. Methods: Thirty-three patients with GD were analyzed by Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) method to detect deletions or insertions in the GBA1 in patients with uncharacterized alleles. Samples from 72 GD patients (n=40 from South Brazil, n=32 from other regions of Brazil) were analyzed by Sanger or next-generation sequencing, and allele frequencies were compared in GD from different regions of Brazil. Functional biomarkers of B12 metabolism were measured in fibroblasts from healthy individuals (n=3), GD untreated patients (type I=1; type II=1; type III=1) and an asymptomatic heterozygous. The expression of transcobalamin (TC) in cells from healthy individuals and GD patients was analyzed by Western blot. Total B12, holo-transcobalamin (holo-TC), total homocysteine (tHcy) and methylmalonic acid (MMA) were prospectively measured in 52 plasma samples from 10 Brazilian patients with GD type I followed by Reference Center for GD from south of Brazil. Results: A deletion in a region of the GBA1 gene was identified in one GD patient presenting incomplete genotype. Thirty-one mutations were identified in Brazilian patients with GD, two of them not described in the literature. GD patients from the southern region of Brazil had different allelic profile than those from other regions of the country. B12 biomarkers levels did not differ between cells from GD patients and healthy individuals. Western blot analysis of whole cell lysates indicated standard content of TC in both cell lines. No patient with GD type I presented low levels of total B12 in plasma samples. Four biomarkers of B12 status suggests that there is no functional deficiency of this micronutrient in GD type I patients. Conclusion: The MLPA technique is a complementary methodology that can be used to analyze the presence of deletions and insertions in patients with GD that do not have defined genotype. Regarding the genetic characterization of Brazilian GD patients, the most frequent allele was N370S. The 12 study suggests that there is a specific allele profile in GBA1 among patients with GD from different regions of Brazil, whereas the N370S, RecNciI, and L444P alleles are more representative in the southern region of the country. The investigation of B12 metabolism in GD patients showed that transport and processing pathways of B12 are overall preserved in GD cells. Analysis of B12 status biomarkers in plasma samples showed that Brazilian GD type I patients present normal levels of B12, in contrast with the previous study that demonstrated high prevalence of low B12 in untreated patients with GD from the Ashkenazi Jewish population. Furthermore, the analysis of functional biomarkers (tHcy and MMA) was not suggestive of B12 deficiency in GD patients. Therefore, glucocerebroside accumulation in lysosomes seems not affect the processing and trafficking of B12, and it not causing a functional impairment of B12 in patients with GD type I