Plasmídeos derivados de vírus para conferir resistência a herbicidas em Eucalyptus urophylla

O gênero Eucalyptus, pertencente à família Myrtaceae, inclui diversas espécies de importância florestal e industrial que se destacam pelas suas excelentes características silviculturais e pela aplicação na produção de madeira maciça, celulose e papel. A geração de variantes geneticamente modificadas (GM) de eucalipto que possam conferir vantagens fenotípicas e, consequentemente, atender à crescente demanda por produtos derivados da madeira, é de grande importância. Porém, a transgenia do eucalipto ainda apresenta grandes limitações, especialmente nas etapas de regeneração de mudas GM derivadas de matrizes “elite”. Recentemente, a tecnologia TraitUP™ foi desenvolvida pela empresa Morflora (Israel) como alternativa para a introdução de genes de interesse em plantas, tendo sido comprovadamente eficaz em diversas espécies e gêneros. O método está fundamentado em vetores virais desarmados denominados “IL-60” (pIR e p1470) contendo o(s) gene(s) de interesse. Tais vetores comportam-se como plasmídeos e são capazes de se propagar pela planta de forma assintomática e epissomal, levando à expressão do(s) gene(s) de modo sistêmico e duradouro. No presente trabalho, foi investigada a aplicabilidade da tecnologia TraitUP™ em Eucalyptus urophylla, gerando e testando versões dos vetores IL-60 contendo genes capazes de conferir resistência a herbicidas e a antibióticos seletivos. Os genes bar (ou pat, fosfinotricinaacetiltransferase) e nptII (neomicina-fosfotransferase), capazes de conferir resistência ao herbicida glifosinato e amônio e ao antibiótico canamicina, respectivamente, foram utilizados no estudo e inseridos no vetor p28_35S-Gateway, variante do vetor pIR (Morflora) adaptado à tecnologia Gateway (Invitrogen). Primers específicos para as sequências codificadoras dos genes foram projetados e utilizados em PCRs para a amplificação das mesmas a partir dos plasmídeos comerciais pWBVec4a (Ming-Bo Wang, 1996) e pCAMBIA2300 (Cambia). Os amplicons resultantes foram ligados direcionalmente no vetor de entrada pENTR/D-TOPO (Invitrogen) e, após, recombinados com o vetor de destino p28_35S-Gateway. Os vetores resultantes p28_35S-bar e p28_35S-nptII tiveram suas identidades e sequências confirmadas por clivagens com enzimas de restrição e por sequenciamento de DNA. Em paralelo às clonagens moleculares, foram realizadas curvas de seleção para a determinação das doses letais mínimas de glifosinato de amônio e de canamicina para a seleção de plantas de E. urophylla cultivadas em hidroponia e em solo, tendo sido obtidos resultados conclusivos para o herbicida. A concentração ideal de glifosinato de amônio para a seleção de plantas em hidroponia foi experimentalmente definida em 10 mg/L e, para plantas cultivadas em solo, em 120 mg/L. No primeiro caso, foram necessários 35 dias de exposição para a seleção, enquanto no segundo caso foram requeridas aplicações por 4 dias. Plântulas de E. urophylla serão inoculadas com o plasmídeo p28_35S-bar e com o plasmídeo auxiliar p1470 via contato direto com as raízes e injeção no caule, em concentração experimental de 20 µg/mL. As plantas inoculadas serão submetidas à seleção nas concentrações e tempo definidos experimentalmente e a resistência será aferida por meio da comparação fenotípica. Ainda, plantas de E. urophylla foram inoculadas com o plasmídeo p28_35S-gfp e com o plasmídeo auxiliar p1470 via contato direto com as raízes e injeção no caule, em concentração experimental de 10 µg/mL, e a expressão de gfp foi avaliada por microscopia de fluorescência.The genus Eucalyptus belongs to the Myrtaceae family and includes several species of industrial and forest importance that stand out for their excellent silvicultural characteristics and their application in the production of solid wood, cellulose pulp and paper. The generation of genetically modified (GM) variants of eucalypts capable to provide phenotypic advantages and consequently meet the increasing demand for wood-derived products is highly required. However, Eucalyptus transgenic techniques still exhibit great limitations, especially when it comes to the regeneration of GM seedlings derived from elite varieties. Recently, an Israeli company named Morflora developed the TraitUP™ technology as an alternative for the introduction of foreign genes into plants. This new method has been proven effective in several plant species and genera and it is based on disarmed viral vectors, called "IL-60" (pIR and p1470), containing the gene(s) of interest. Such vectors behave as plasmids and are capable to propagate through the plant in an asymptomatic and epizomal manner, leading to the expression of the gene(s) in a systemic and durable way. The present work aimed to investigate the applicability of the TraitUP™ technology in Eucalyptus urophylla, through the generation and test of versions of IL-60 vectors containing genes capable of conferring resistance to selective herbicides and antibiotics. The genes bar (or pat, phosphinothricine acetyltransferase) and nptII (neomycin phosphotransferase), which confer resistance to the herbicide glufosinate-ammonium and to the antibiotic kanamycin, respectively, were used in this study and inserted into the p28_35SGateway vector, a variant of the pIR vector (Morflora) adapted to the Gateway technology (Invitrogen). Specific primers for the coding sequences of the genes were designed and used in PCRs for their amplification from the commercial plasmids pWBVec4a (Ming-Bo Wang, 1996) and pCAMBIA2300 (Cambia). The obtained amplicons were ligated into the pENTR/D-TOPO entry vector (Invitrogen) and then recombined with the p28_35S-Gateway final vector. The identities of the resulting vectors p28_35S-bar and p28_35S-nptII were confirmed by restriction enzyme digestions and DNA sequencing. In addition to molecular cloning experiments, we established selection curves to determine minimal lethal doses of glufosinateammonium and kanamycin required to select E. urophylla plants cultivated under hydroponics and soil conditions. The ideal concentration of glufosinate-ammonium for plant selection under hydroponics and soil were experimentally established at 10 mg/L and 120 mg/L, respectively, while the ideal intervals for selection were 35 and 4 days, respectively. E. urophylla seedlings shall be inoculated with plasmid p28_35S-bar and the helper plasmid p1470 through root uptake and injection into the stem, both at an experimental concentration of 20 μg/mL. The inoculated plants will be subjected to selection at the concentration and time determined experimentally and resistance will be measured by means of phenotypic comparison. Furthermore, E. urophylla plants were inoculated with p28_35S-gfp and the helper plasmid p1470 through root uptake and stem injection at an experimental concentration of 10 μg/mL, and gfp expression was assessed by fluorescence microscopy