Estudo da DNA metiltransferase 2 (Dnmt2) e metilação do DNA no gênero Drosophila

Fenômenos epigenéticos têm sido amplamente caracterizados em genomas de vertebrados, especialmente mamíferos, e a metilação do DNA é um mecanismo chave para a regulação epigenética. Os sistemas de metilação do DNA de vertebrados e invertebrados apresentam diferenças marcantes, mas as implicações evolutivas dessas diferenças só recentemente começaram a ser estudadas. Nesta tese apresentamos primeiramente a investigação sobre a recorrência da metilação sexo-específica de genes de DNA ribossomal (rDNA), previamente descrita para adultos de Drosophila willistoni, estendendo a análise a outros grupos de espécies do subgênero Sophophora de Drosophila, ao qual o principal organismo modelo do gênero, D. melanogaster, também pertence. Utilizamos neste estudo, espécies dos grupos willistoni, melanogaster, saltans e obscura do gênero Drosophila e os resultados sugerem que a metilação diferencial entre os sexos, para o gene estudado, seja recorrente em Drosophila tropicalis e D. insularis, duas espécies do subgrupo críptico willistoni. Nossos achados indicam que a metilação pode apresentar importantes diferenças, mesmo dentro de grupos de espécies proximamente relacionadas, fornecendo dados interessantes para o conhecimento deste complexo grupo de espécies neotropicais. Alguns estudos têm sido realizados no intuito de decifrar os mecanismos de ação da DNA metiltransferase 2 (Dnmt2), identificada como responsável pela metilação do DNA nos genomas de Drosophila, mas a grande maioria dos estudos no gênero, utiliza a espécie Drosophila melanogaster . Pouco se sabe sobre a conservação dos padrões de metilação do DNA e do quanto ela seria importante para a evolução de espécies relacionadas. Neste sentido, realizamos um estudo pioneiro buscando homólogos do gene Dnmt2 em um grande número de espécies da família Drosophilidae, tentando traçar um perfil evolutivo do gene, uma vez que anteriormente encontramos diferenças em padrões de metilação de DNA entre espécies próximas. Nossos resultados mostram a conservação do gene Dnmt2 entre as espécies, pois nossas análises filogenéticas recuperam os três principais clados da família Drosophilidae. No mesmo estudo, realizamos o mapeamento físico do gene Dnmt2 por hibridação in situ em cromossomos politênicos de D. willistoni. Evidenciamos que a o gene Dnmt2 foi mapeado próximo à inserção de elementos transponíveis, previamente descritos, e de um ponto de quebra de uma inversão. Estes resultados são promissores, pois as relações entre rearranjos cromossômicos e expressão de genes próximos a eles têm sido alvo de importantes pesquisas. Além disso, por busca in silico, identificamos também a preservação da sintenia cromossômica descrita para as 12 espécies de Drosophila cujos genomas se encontram disponíveis. Em todas as espécies, assim como em D. willistoni, o gene se encontra nos braço cromossômicos correspondentes aos elementos B de Muller A caracterização da DNA metiltransferase 2 e estudos relacionados às prováveis funções desta enzima têm sido foco constante de investigações. Drosophila é um dos organismos que possuem somente a Dmnt2, os chamados Dnmt2-only. Homólogos para Dnmt2 já foram identificados em praticamente todos os modelos biológicos utilizados, entretanto suas funções biológicas ainda não foram efetivamente determinadas. Devido a alguns trabalhos apontarem para um papel da Dnmt2 no início do desenvolvimento de alguns invertebrados, realizamos uma investigação para detectar os padrões de expressão de Dnmt2 em D. willistoni. Primeiramente, nós demonstramos a presença de transcritos não somente em embriões, como fora previamente descrito, mas em outros estágios de desenvolvimento e em tecidos somáticos e germinativos. Nas análises quantitativas, encontramos níveis mais altos de expressão durante a oogênese, o que pode ser indício de uma função importanteda Dnmt2 na regulação de genes de desenvolvimento e de diferenciação de ovócitos nesta espécie, atuando ainda em nível pré-zigótico.Epigenetic phenomena have been widely characterized in the genomes of vertebrates, especially mammals, and DNA methylation is a key mechanism for epigenetic regulation. DNA methylation systems of vertebrates and invertebrates differ markedly, but the evolutionary implications of these differences only recently begun to be studied. In this thesis we initially present an investigation about the recurrence of sex-specific methylation of DNA ribosomal genes (rDNA), previously described for adults in Drosophila willistoni. We spread out the analysis to other species groups of Sophophora subgenus of Drosophila to which the main model organism of the genus, D. melanogaster, also belongs. In this study we investigated species from willistoni, melanogaster, obscura and saltans groups of Drosophila genus and our results suggest that differential methylation between sexes in the gene studied, occurs only in Drosophila tropicalis and D. insularis, both species of the cryptic willistoni subgroup. Our findings indicate that DNA methylation may present important differences, even in closely related species, providing interesting data to the knowledge of this complex Neotropical group of species. Studies have been conducted to understand the DNA methyltransferase 2 (Dnmt2) mechanisms, the enzyme identified as responsible for the DNA methylation in the genomes of Drosophila, but the most studies use Drosophila melanogaster representing the entire genus. Little is known about the conservation of DNA methylation patterns and whether it would be important in evolutionarily related species In this sense, we conducted a pioneering and widespread study aiming to find Dnmt2 gene homologs in a large number of species of the Drosophilidae family and thus try to trace an evolutionary profile of the gene, since there are differences in DNA methylation patterns among species. Our results demonstrated the Dnmt2 conservation among species, since our phylogenetic analysis recovered three major clades of the family Drosophilidae (virilis-repleta and quinariatripunctata radiations of Drosophila subgenus and Sophophora subgenus). Besides, we physically mapped the Dnmt2 gene on polytene chromosomes of D. willistoni by in situ hybridization. It was also possible to observe that the section where Dnmt2 is located is next to transposable elements insertions and to an inversion breakpoint, previously described. These results are promising because the relationship between chromosomal rearrangements and gene expression positioned close to them has been subject to important discoveries. We also identified the preservation of chromosomal synteny described for the 12 species that have their genomes sequenced available. For in silico searches, we found that sequences homologs to the Dnmt2 gene are on chromosomal arms corresponding to the Muller B element Characterization of DNA methyltransferase 2 activities and investigations about putative functions of this enzyme has been focus of recent studies. Drosophila is one of those organisms so-called “Dnmt2-only” since they only utilizes Dnmt2 enzyme. Dnmt2 homologs have been identified in virtually all biological models; however the biological function performed by this enzyme has not yet been determined. Since some studies indicate a Dnmt2 role in early development of some invertebrates, we conducted a study to analyze the Dnmt2 expression patterns in D. willistoni. Our data demonstrated transcripts not only in embryos, as was previously described, but in other development stages, in somatic and germinative tissues. We found higher levels of expression during oogenesis, which may indicate an important role in gene regulation of development and differentiation of oocytes in this species, acting in pre-zygotic levels