Analysis and characterization of environmental samples from the Enterobacteriaceae family for the presence of β-lactam resistance gene

A resistência das bactérias aos antibióticos é um problema recorrente que dificulta o tratamento de infecções causadas por bactérias. Alguns membros da família Enterobacteriaceae são responsáveis por carrear e disseminar diferentes mecanismos de resistência, entre estes está a capacidade de algumas bactérias em produzir enzimas como as β-lactamases. Tendo em vista esta problemática o objetivo do presente estudo foi detectar/identificar através de análises fenotípicas e genotípicas quais os genes de resistência presentes em amostras ambientais. Para tanto os primeiros ensaios realizados foram os fenotípicos: teste de Hodge Modificado (MHT), testes com inibidores como ácido fenilborônico (APB), EDTA e cloxacilina, e o teste confirmatório para Extended-Spectrum β-lactamase (ESBL). Foram isoladas 131 amostras as quais passaram por uma triagem inicial através do antibiograma, utilizando os antimicrobianos: cefotaxima (30μg), cefpodoxima (10μg), ceftazidima (30μg), ertapenem (10μg), meropenem (10μg), aztreonam ( 30μg). Destas, 62 amostras foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano as quais foram submetidas aos demais testes fenotípicos. Os resultados mostram que 40 amostras apresentaram perfil positivo para pelo menos um dos testes fenotípicos. Estas 40 amostras foram submetidas a PCR Multiplex para detecção e caracterização dos principais genes de resistência à β-lactamases: β-lactamase de espectro extendido (ESBL), Carbapenemase e β-lactamase AmpC. Uma vez detectado os genes, foi realizado o sequenciamento dos amplicons para confirmação da presença dos mesmos A relação clonal foi estabelecida utilizando XbaI através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE). Os resultados mostraram que em 85% dos isolados foi detectada a presença de genes de resistência, dentre os quais observamos as seguintes espécies: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae. A prevalência foi para os genes de β-lactamases com 77,5% (TEM, SHV e CTX-M) seguido por Carbapenemase (KPC e GES) com 45% e AmpC (ACT/MIR) com 2,5%. Este foi o primeiro relato desses genes de resistência em isolados ambientais no município de Porto Alegre/RS. Oito amostras apresentaram três genes de resistência, quatorze amostras dois e 12 com um gene cada. A análise da eletroforese em campo pulsado mostrou uma relação clonal entre alguns isolados de K. pneumoniae que foram separados em três grupos diferentes (K1, K2, K3). Entre os isolados de Enterobacter sp. não foi possível estabelecer uma relação clonal. Fica claro com o trabalho a ocorrência e a capacidade de disseminação desses genes de resistência em amostras ambientais e o potencial risco à saúde da comunidade em geral, tornando-se um problema de saúde pública.Bacteria resistant to antibiotics are a recurring problem which makes difficult the treatment of bacterial infections. Some members of the Enterobacteriaceae family are responsible for carrying and disseminating different mechanisms of resistance. Among them are strains which produce enzymes such as β-lactamases. In view of this problem the objective of this study was to detect / identify through phenotypic and genotypic analysis which resistance genes present in environmental isolates. For this the first trials were the phenotypic assys: Hodge test Modified (MHT), tests with inhibitors such as phenylboronic acid (APB), EDTA and cloxacillin, and confirmatory test for Extended-Spectrum β-lactamase (ESBL). In the first screening 131 isolates were submitted to antibiogram using following antimicrobials: cefotaxime (30μg), cefpodoxime (10mg), ceftazidime (30μg), ertapenem (10mg), meropenem (10mg), aztreonam (30μg). Out of 62 isolates were resistant to at least one antimicrobial were submitted to other phenotypic tests. The results show that 40 isolates show a positive profile for at least one phenotypic test. These 40 isolates were submitted to Multiplex PCR for detection and characterization of the major resistance genes for β- lactamases: β-lactamase extended spectrum (ESBL), carbapenemase and β- lactamase AmpC. Once detected the genes, the sequencing of amplicons were performed in order to confirm the presence of the genes. The clonal relationship was established using XbaI endonuclease using Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The results showed that in 85% of the isolates the presence of resistance genes was detected, among which we observed the following species: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae The prevalence was for the β-lactamase gene with 77.5% (TEM, SHV and CTX-M) followed by carbapenemase (KPC and GES) with 45%, and AmpC (ACT / MIR) with 2.5%. This was the first report where these resistance genes were detected in environmental isolates in the city of Porto Alegre/RS. Eight isolates had three resistance genes, fourteen isolates two genes and 12 with one gene. The analysis of pulsed field gel electrophoresis showed a clonal profile among some K. pneumoniae strains which were separated into three groups (K1, K2, K3). Among Enterobacter sp. strains it was not possible to establish a clonal profile. It is clear from the work the occurrence and the ability of disseminate these resistance genes among environmental isolates and the potential health risk to the community and so becoming a public health problem