Morphology of zebrafish ovarian follicles after cryopreservation using a metal capsule

O apelo pela conservação ambiental e o significativo aumento no número de organismos cultivados de alto valor genético demandam tecnologias que permitam conservar sua genética, mesmo após a morte do animal. A criopreservação de gametas possibilita a preservação da genética de espécies ameaçadas e de interesse comercial, prolongando sua vida reprodutiva evitando assim a perda de material genético por doenças, catástrofes, transferência de animais ou perda do habitat natural. A criopreservação tem sido aplicada à conservação de ovários e tecido ovariano, no entanto, há muitas controvérsias acerca de qual seria o melhor protocolo a ser utilizado. Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia do tecido ovariano de zebrafish criopreservado em cápsula de metal com o uso de diferentes soluções crioprotetoras. As soluções crioprotetoras utilizadas foram: 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol (SC1); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO (SC2); 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol + 0,5 M sacarose (SC3); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose (SC4). Após o descongelamento a integridade de cinco estágios de desenvolvimento folicular foi avaliada em cada grupo. A morfologia celular foi observada através de análise histológica. A análise dos dados mostrou que os folículos em estágio I e II foram os melhores criopreservados em todos os grupos experimentais. Sendo que, os grupos SC4 e SC2 foram os que apresentaram os melhores resultados, respectivamente com 88,26% e 84,2% de folículos sem alterações morfológicas. Já os estágios foliculares mais avançados de desenvolvimento (estágios IV e V) apresentaram-se com alterações em todos os grupos. Portanto, apesar do sucesso na criopreservação dos estágios foliculares mais iniciais (I e II) foi possível identificar alterações morfológicas em todos os grupos avaliados. Dentre as principais alterações identificadas estão a aglutinação do citoplasma e enrugamento e ruptura da membrana do envelope celular. Ao avaliar os resultados pode-se concluir que apesar do uso da capsula de metal em associação com as soluções SC4 e SC2 apresentarem os melhores resultados, as soluções SC1 e SC3 também foram eficientes na manutenção da integridade morfológica de folículos imaturos, e portanto essa metodologia pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de folículos imaturos.The appeal for environmental conservation and the significant increase in the number of farmed organisms with high genetic value demand technologies to allow preserving their genetics, even after the death. Cryopreservation of gametes allows the preservation of genetics of the endangered and commercial species, prolonging their reproductive life. Furthermore, this technology prevents the loss of genetic material caused by diseases, disasters, transfer of animals or loss of natural habitat. Cryopreservation has been applied to the conservation of ovaries and ovarian tissue, however, there are many controversies regarding what would be the best protocol to use. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphology of cryopreserved zebrafish ovarian tissue using a metal capsule with four different cryoprotectant solutions. The cryoprotectant solutions used were: 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol (CS1); 1.5M methanol + 5.5 M Me2SO (CS2); 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose (CS3); Methanol + 1.5 M 5.5 M 0.5 M sucrose + Me2SO (CS4). After heating the integrity of the five stages of follicular development was assessed in each group. Cell morphology was observed by histological analysis. The thermal gradient inside the capsule and the sample was verified by a thermistor Pt500, model Keithley 2001A. The data analysis shows that the follicles at stage I and II were better cryopreserved among all experimental groups. The treatments CS4 and CS2 showed the best results, respectively with 88.26% and 84.2% of follicles without morphological changes in stage I. The most advanced follicular development stages (stages IV and V) showed changes in all treatments. Therefore, despite the successful cryopreservation of earlier follicular stages (I and II), it was possible to identify morphological changes in all the groups. Among the main changes identified, agglutination of cytoplasm and rupture of cell and wrinkling of the egg envelope could be observed. Despite the use of the metal capsule in association with the CS4 and CS2 solutions showed the best results, CS1 and CS3 solutions were also effective in maintaining the morphological integrity of immature follicles, therefore this method can be successfully used in the cryopreservation of immature follicles