Estudos bioquímicos em pacientes com Doença de Fabry antes e durante a terapia de reposição enzimática de longa duração : novos achados fisiopatológicos e o efeito in vitro da globotriaosilesfingosina

A doença de Fabry (DF, OMIM 301500) é uma doença lisossômica de depósito de herança ligada ao cromossomo X causada por mutações no gene GLA que levam à tradução da enzima lissomal α-galactosidase A (α-gal A, EC 3.2.1.22) com atividade deficiente ou nula. Como consequência, os substratos dessa enzima (majoritariamente globotriaosilceramida – Gb3 - e globotriaosilesfingosina – liso-Gb3) acumulam-se em diversos tecidos e fluidos corporais dos pacientes com DF. Estudos indicam que inflamação, estresse oxidativo e nitrosativo podem estar envolvidos na fisipatologia da DF, que ainda não está completamente esclarecida. Foi descrito previamente um aumento de parâmetros inflamatórios e próoxidantes em pacientes com DF durante a terapia de reposição enzimática (TRE), todavia se faz necessário avaliar tais parâmetros antes do início da TRE. Através de ensaios in vivo e in vitro em amostras de sangue e de urina de pacientes com DF, avaliamos alterações de estado redox, dano oxidativo a biomoléculas (incluindo lipídeos, proteínas e DNA) e níveis urinários de Gb3. No intuito de investigar os efeitos biológicos do mais recente biomarcador proposto para a DF, o liso-Gb3, realizamos ensaios in vitro em células embrionárias de epitélio renal humano (HEK-293T). Demonstramos, pela primeira vez, aumento de dano ao DNA em pacientes com DF. Ainda, observamos aumento de geração de espécies reativas nas mesmas amostras (através da sonda diclorofluoresceina - DCF) e, através do ensaio cometa com endonucleases, verificamos que o dano ao DNA é de natureza oxidativa em purinas nesses pacientes. Para avaliar a capacidade de reparo de DNA frente a um insulto oxidativo, realizamos o ensaio de desafio com peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual demonstrou que os pacientes possuiam reparo aumentado (provavelmente como resposta ao estresse crônico), porém não suficientemente eficaz para reduzir o dano oxidativo basal a purinas a nível de indivíduos saudáveis. Observamos também que pacientes com DF antes de iniciar a TRE já possuíam níveis aumentados de lipoperoxidação (através da medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS - e malondialdeído – MDA) e de estresse nitrosativo (medido através de nitrato e nitrito urinários), bem como desequilíbrios no sistema redox da glutationa (GSH - principal antioxidante intracelular, avaliado através da medida de GSH e da atividade das enzimas glutationa redutase, GR, e glutationa peroxidase, GPx). Após a TRE de longa duração (aproximadamente cinco anos), a lipoperoxidação e o estresse nitrosativo continuaram aumentados, porém o metabolismo da GSH foi normalizado a nível de indivíduos saudáveis (provavelmente também como resposta adaptativa ao estresse). Os níveis urinários de Gb3 diminuíram com a TRE, porém permaneceram ainda significativamente aumentados em relação aos controles. Concentrações de liso-Gb3 similares às encontradas no plasma de pacientes com DF tiveram efeito citotóxico significativo nas células renais, causaram dano ao DNA (incluindo dano oxidativo a purinas e pirimidinas) e induziram aumento na atividade da enzima antioxidante catalase (CAT) e na expressão da poli(ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1, enzima-chave no reparo de dano ao DNA por excisão de bases - BER). Por fim, analisando em conjunto os dados in vitro, podemos sugerir um mecanismo de ação para o liso-Gb3 no qual o H2O2, espécie reativa de conhecido papel sinalizador, atua como mediador. O H2O2 também ocupa papel central no mecanismo sugerido através dos estudos in vivo, de modo que os achados são complementares entre si e fornecem novos dados acerca da fisiopatologia da DF que podem ser úteis a estudos futuros na busca de terapias complementares à TRE, necessárias para a melhora clínica e de qualidade de vida dos pacientes com DF.Fabry disease (FD, OMIM 301500) is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in GLA gene that lead to translated lysosomal enzyme α-galactosidade A (α-gal A, EC 3.2.1.22) with deficient or absent activity. Consequently, the enzyme’s substrates (mainly globotriaosylceramide – Gb3 and glotriaosylsphingosine – lyso-Gb3) accumulate in various tissues and body fluids of FD patients. Studies have pointed that inflammation, oxidative and nitrosative stress may be involved in FD pathophysiology, which is not completely known. It was previously described an increase of inflammatory and prooxidative parameters in FD patients during enzyme replacement therapy (ERT), although it is necessary to evaluate these parameters before the beginnig of ERT. Using in vivo and in vitro assays in blood and urine samples of FD patients, we evaluated abnormalities of redox status, oxidative damage to biomolecules (including lipids, proteins and DNA) and Gb3 urinary levels. In order to investigate the biological effects of the latest described biomarker for FD, lyso-Gb3, we performed in vitro assays in human embryonic kidney epithelial cells (HEK-293T). We demonstrated, for the first time, increased DNA damage in FD patients. Then, we observed increased reactive species generation (by dichlorofluorescein – DCF - probe) in the same samples and, by comet assay with endonucleases, we verified that DNA damage has an oxidative origin in purines in these patients. In order to evaluate repair capacity towards an oxidative insult, a challenge assay with hydrogen peroxide (H2O2) was performed, which demonstrated that patients had increased repair (probably as response to chronic stress), but not sufficiently effective to reduce basal oxidative damage in purines to healthy individuals’ levels. We also observed that FD patients even before initiating ERT already had increased lipid peroxidation levels (by thiobarbituric acid reactive species - TBARS - and malondialdehyde - MDA content) and nitrosative stress (by urinary nitrate and nitrite), as well as imbalances in glutathione (GSH) redox system (GSH – the main intracellular antioxidant, evaluated by GSH content and glutathione reductase, GR, and glutathione peroxidase, GPx, enzyme activities). After long-term ERT (approximately five years), lipid peroxidation and nitrosative stress remained increased, although GSH metabolism was restored to the level of healthy subjects (also probably as an adaptive response to stress). Gb3 urinary levels decreased after ERT, but remained already increased when compared to controls. Lyso-Gb3 levels similar to that found in plasma of FD patients caused significative cytotoxic effect on kidney cells, caused DNA damage (including oxidative damage to purines and pyrimidines) and induced increase in the antioxidant enzyme catalase (CAT) activity and poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) expression (key enzyme in DNA base excision repair). To conclude, analysing together the in vitro data, we could suggest a mechanism of action to lyso-Gb3 in which H2O2, reactive specie with well known signaling function, acts as a mediator. H2O2 has also a central role in the mechanism proponed by the in vivo studies, so that the findings are complementary and provide new data about FD pathophysiology that could be useful to future studies looking for complementary therapies to ERT, necessary to improvement in clinical aspects and life quality of FD patients