Exendin-4 na prevenção de danos teciduais decorrentes da morte encefálica e no controle bioenergético da célula β pancreática

A reposição de ilhotas pancreáticas é uma forma eficaz de se restabelecer a homeostase glicêmica em pacientes com diabetes mellitus tipo 1 com controle metabólico instável (“DM1 lábil”). Entretanto, ao longo do processo de isolamento, a partir do pâncreas do doador em morte encefálica (ME) e posterior enxerto no receptor, perdas importantes, tanto no número quanto na qualidade das ilhotas, limitam a eficácia do procedimento de transplante. Frequentemente, transplantes sequenciais de dois ou até três pâncreas são necessários para se atingir a independência de insulina exógena. Mesmo que centros transplantadores já reportem boas taxas de sucesso, utilizando apenas um doador por paciente, a escassez de doadores ainda é um forte limitador dessa terapêutica, dificultando a adoção da reposição de ilhotas como prática clínica de rotina para o tratamento de pacientes com DM1 lábil. Entre os fatores responsáveis pela perda das ilhotas, pode-se destacar o intenso estresse inflamatório produzido pela ME do doador. Semelhantemente ao que ocorre com ilhotas pancreáticas, estudos clínicos e experimentais evidenciam que a ME induz danos teciduais irreversíveis em vários outros órgãos e tecidos destinados a transplante, tais como o coração, pulmões, rins e fígado. Órgãos provenientes de doadores vivos, em geral, resultam em desfechos pós-transplante mais favoráveis quando comparados às taxas de sucesso obtidas com órgãos derivados de doadores cadavéricos. Estudos recentes demonstram que a Exendin-4, um análogo do glucagon-like peptide-1 (GLP-1), possui propriedades anti-inflamatórias, pró-proliferativas e de redução da apoptose de células β pancreáticas. Interessantemente, esse mesmo análogo também apresentou efeitos protetores em diversos modelos animais de doenças hepáticas. Sendo assim, nós hipotetizamos que a administração dessa droga a doadores cadavéricos poderia amenizar os danos causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no tecido hepático, preservando a qualidade desses tecidos para uso em transplantes. A fim de testar a hipótese sugerida, desenvolveram-se dois estudos em modelo murino de ME. A administração de Exendin-4 a animais com ME foi avaliada em relação a diversos parâmetros de dano e qualidade teciduais, além de marcadores inflamatórios e expressão gênica de genes ligados a inflamação e estresse. Grupos de animais que não sofreram ME ou que sofreram ME mas não receberam a droga foram utilizados como controles nesses experimentos. Os resultados gerados indicam que a administração de Exendin-4 a ratos em ME melhora a viabilidade e a função de ilhotas pancreáticas isoladas. Isso foi acompanhado por uma redução na expressão gênica da citocina pró-inflamatória Interleukin-1 beta (Il1b) no tecido pancreático. Além disso, o tratamento com Exendin-4 também modulou a expressão de genes que codificam para proteínas de controle do estresse oxidativo celular, a superoxide dismutase-2 (Sod2) e a uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes relacionados ao estresse do retículo endoplasmático, C/EBP Homologous Protein (Chop) e Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), também conhecido como immunoglobulin heavy-chain binding protein (BiP), tiveram suas expressões reduzidas em ilhotas isoladas de animais tratados. Recentemente, tem sido demonstrado que o estresse do retículo endoplasmático participa no mecanismo de morte celular da célula β induzida por citocinas. Assim, nós sugerimos que o efeito protetor da Exendin-4 contra os danos causados pela ME provavelmente se dê através de uma diminuição da inflamação e do estresse oxidativo no ambiente pancreático, o que se traduz em uma menor ativação do estresse do retículo endoplasmático na célula β, consequentemente, reduzindo a morte celular nas ilhotas isoladas. Em ressonância com os efeitos benéficos observados nas ilhotas, animais tratados também apresentaram níveis reduzidos de marcadores de dano hepático circulantes, além de uma diminuição significativa nas taxas de apoptose no tecido hepático. Os resultados aqui apresentados, portanto, sugerem que a administração de Exendin-4 a doadores cadavéricos de múltiplos órgãos tem o potencial para minimizar os efeitos deletérios causados pela ME nas ilhotas pancreáticas e no fígado. O GLP-1, uma incretina gastrointestinal secretada pelas células L do intestino delgado, estimula a secreção de insulina dependente de glicose nas células β pancreáticas. Estudos recentes demonstram que o GLP-1 é capaz de proteger as células β do estresse oxidativo e dos danos inflamatórios, os quais são considerados fatores importantes não apenas na mediação dos danos teciduais induzidos pela ME, mas também na patogênese do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Tal efeito estimulatório dependente de glicose pode ser explorado como uma estratégia terapêutica alternativa para o tratamento de pacientes com DM2, por reestabelecer a homeostase glicêmica e eliminar o risco de hipoglicemia associada à injeção exógena de insulina. Recentemente, vários ensaios clínicos confirmaram os efeitos benéficos de análogos do GLP-1, que incluem um melhor controle glicêmico e perda de peso, resultando na aprovação de tais análogos para o tratamento clínico do DM2. No entanto, os mecanismos moleculares que medeiam a estimulação da secreção de insulina pelo GLP-1 não são totalmente conhecidos. Isso gera a necessidade do desenvolvimento de estudos bioquímicos detalhados para elucidação das vias de transdução de sinal intracelulares responsáveis pela execução dos efeitos estimulatórios do GLP-1 na secreção de insulina. Devido à dependência de glicose para a ativação do seu efeito estimulatório, nós hipotetizamos que o GLP-1 possa atuar na regulação da atividade bioenergética de metabolismo da glicose na célula β. Utilizando-se da linhagem celular clonal secretora de insulina, BRIN-BD11 e ilhotas isoladas de camundongos, nós demonstramos que a sinalização através do receptor do GLP-1 (GLP-1R) promove a glicólise e, consequentemente, aumenta o conteúdo de ATP intracelular. Os dados deste estudo sugerem que isso provavelmente seja mediado pela ativação da mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resultando na acumulação do fator de transcrição Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), que por sua vez promove um aumento na expressão gênica de genes que codificam para enzimas da via glicolítica. Sugere-se que essa indução na taxa glicolítica possa reforçar o acoplamento metabólico entre estímulo e secreção, resultando no aumento da secreção de insulina dependente de glicose mediada por GLP-1.Replacement of pancreatic islets is an effective way to restore glucose homeostasis in patients with type 1 diabetes mellitus with unstable metabolic control ("T1DM labile"). However, along the isolation procedure from brain dead organ donors and later recipient engraftment, significant losses, both in number and quality of islets take place, limiting the effectiveness of islet transplantation as a whole. Often, sequential transplants of two or three donors are necessary in order to achieve exogenous insulin independence. Even with recent advances and transplant centers already reporting good success rates using only one donor per patient, the shortage of donors is still a strong limitation of this therapy, hindering the adoption of islets reposition as routine clinical practice for the treatment of patients with T1DM labile. Several factors are responsible for islets loss, including intense inflammatory stress produced by the donor’s brain death (BD). Similarly to what happens with pancreatic islets, clinical and experimental studies show that BD induces irreversible tissue damage in several other organs and tissues destined for transplantation, such as heart, lungs, kidneys and liver. In general, organs from living donors result in more favorable post-transplant outcomes when compared to organs procured from cadaveric donors. Recent studies indicate that Exendin-4, a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analog, has anti-inflammatory, proliferative and anti-apoptotic properties in pancreatic β cells. Interestingly, this analog has also shown protective effects in several animal models of liver disease. Thus, we hypothesized that administration of this drug to cadaveric donors could mitigate damage caused by BD in the pancreatic islets and liver tissue. Such treatment could preserve islets and liver quality for use in transplantation and possibly improve outcomes. In order to test the suggested hypothesis, we developed two studies using a rat model of BD. Administration of Exendin-4 to animals that underwent experimental BD was evaluated against various parameters of tissue damage and quality, as well as inflammatory markers and gene expression of genes linked to inflammation and stress. Groups of animals that did not undergo BD or that underwent BD, but have not been given the drug were used as controls in these experiments. Results generated in these studies indicate that administration of Exendin-4 to brain dead rats improves the viability and function of isolated pancreatic islets. This was accompanied by a decrease in gene expression of the pro-inflammatory cytokine Interleukin-1 beta (Il1b) in the pancreatic tissue. In addition, treatment with Exendin- 4 also modulated the expression of genes encoding cellular oxidative stress control proteins, the superoxide dismutase-2 (Sod2), and uncoupling protein-2 (Ucp2). Genes related to stress of the endoplasmic reticulum (ER), C/EBP Homologous Protein (Chop) and Heat Shock 70kDa Protein 5 (Hspa5), also known as heavy-chain binding protein immunoglobulin (BiP), were found to be reduced in islets isolated from treated animals. Recently, ER stress has been shown to participate in the mechanism of β cell death induced by pro-inflammatory cytokines. Thus, we suggest that the protective effect of Exendin-4 against damage caused by BD probably occurs through a decrease in inflammation and oxidative stress in the pancreatic environment, which translates into a lower activation of ER stress in the β cells, hence reducing cell death of isolated islets. In resonance with the beneficial effects observed in islets, treated animals also showed reduced levels of circulating liver damage markers, and a significant decrease in the rate of apoptosis in the liver. Our results, therefore, suggest that administration of Exendin-4 to cadaveric organ donors has the potential to minimize the deleterious effects caused by BD in the pancreatic islets and liver. GLP-1, a gastrointestinal incretin secreted by the L-cells of the small intestine, stimulates insulin secretion in a glucose-dependent manner from pancreatic β cells. Recent studies have shown that GLP-1 is able to protect β cells from oxidative stress and inflammatory damage, which are considered important factors not only in mediating tissue damage induced by BD, but also in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Such glucose-dependent stimulatory effect can be exploited as an alternative therapeutic strategy for the treatment of patients with T2DM in order to reestablish glucose homeostasis and to eliminate the risk of hypoglycemia associated with exogenous insulin injection. Recently, several clinical trials have confirmed the beneficial effects of GLP-1 analogs, which include better glycemic control and weight loss, resulting in the approval of such analogs for the clinical treatment of T2DM. However, the molecular mechanisms that mediate stimulation of insulin secretion by GLP-1 are not fully characterized. Thus, detailed biochemical studies aiming at elucidating intracellular signal transduction pathways responsible for the execution of GLP-1 stimulatory effects on insulin secretion are of high interest. Due to glucose-dependence for activation of its stimulatory effect, we hypothesized that GLP-1 may act in the regulation of β cell bioenergetics and glucose metabolism. Using the clonal rat insulin-secreting cell line BRIN-BD11, and isolated mouse islets, we have demonstrated that signaling via the GLP-1 receptor (GLP-1R) promotes glycolysis and consequently increases intracellular ATP content. Our data suggest that this is likely mediated by activation of the mammalian Target of Rapamycin (mTOR), resulting in the accumulation of the transcription factor Hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), which, in turn, promotes gene expression of genes that encode for glycolytic enzymes. We suggest that such increase in the glycolytic rate strengthens coupling between metabolic stimulus and secretion, ultimately resulting in exacerbated glucose-induced insulin secretion