Xantones, benzopyrans and dimeric phloroglucinols in tissue cultures of Hypericum species native from South of Brazil

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal.Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites