Purification, characterization and evaluation of toxicity of a peptide produced by Bacillus subtilis subsp. spizezrnii with antimicrobial activity against Haemophilus parasuis

Haemophilus parasuis é uma das primeiras e mais prevalentes bactérias colonizadoras de leitões, que afetam a população de suínos, entre 2 semanas a 4 meses de idade, causando a doença de Glässer. O objetivo deste trabalho foi purificar, caracterizar e avaliar a toxicidade de um peptídeo com atividade antimicrobiana frente a H. parasuis produzido por Bacillus subtilis subsp. spizezinii. A substância antimicrobiana foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-50) e cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose). A taxa de purificação foi cerca de 100 vezes com um rendimento de 0,33%. O peptídeo apresentou massa molecular de 1.083 Da e sua sequência foi determinada por espectrometria de massa (NRWCFAGDD). A inibição completa do crescimento de H. parasuis foi observada quando testada com concentração de 20 Gg/mL do peptídeo antimicrobiano (AMP) após 20 min de exposição. O peptídeo foi testado para determinar a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração fungicida mínima (MFC) contra diferentes isolados clínicos de leveduras susceptíveis. O peptídeo inibiu Candida glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, mas não foi capaz de inibir Trichosporon asahii e Cryptococcus neoformans. O AMP foi testado em relação ao potencial citotóxico em tecido de suínos, sendo que o resultado da avaliação histopatológica do músculo esquelético, fígado, coração, rim e cérebro incubados com esta substância e também incubados com nisina não mostraram lesões microscópicas. Células suínas tratadas com as diferentes frações purificadas resultaram em aumento dos níveis de liberação de lactato desidrogenase e hemoglobina em comparação com a nisina. Tendo em vista a relevância desta pesquisa, estudos complementares devem ser realizados para avaliar o potencial biotecnológico deste composto químico.Haemophilus parasuis is one of the earliest and most prevalent bacteria colonizing piglets, affecting the population of pigs from 2 weeks to 4 months of age, causing disease Glasser. The aim of this study was to purify, characterize and evaluate the toxicity of a peptide with antimicrobial activity against H. parasuis produced by Bacillus subtilis subsp. spizezinii. The antimicrobial substance was purified by ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography (Sephadex G-50) and ion exchange chromatography (DEAE-cellulose). The purification rate was about 100 fold with a yield of 0.33%. The peptide had a molecular mass of 1,083 Da and its sequence was determined by mass spectrometry (NRWCFAGDD). The complete inhibition of H. parasuis growth was observed when tested at 20 μg/mL concentration of the antimicrobial peptide (AMP) after 20 min of exposure. The peptide was tested to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) against different yeast strains susceptible. The peptide inhibited Candida glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis, but was not able to inhibit Trichosporon asahii and Cryptococcus neoformans. The AMP was tested against the cytotoxic potential in tissue of pigs, and the result of the histopathological evaluation of skeletal muscle, liver, heart, kidney and brain incubated with this substance and also incubated with nisin showed no microscopic lesions. Pig cells treated with the different purified fractions resulted in increased levels of lactate dehydrogenase release and hemoglobin and compared to nisin. Given the relevance of this research, further studies should be conducted to evaluate the biotechnological potential of this chemical compound