Marcação e detecção de proteínas sintetizadas durante o desenvolvimento estrobilar de Echinococcus granulosus IN VITRO

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, causador da hidatidose cística. Durante o ciclo de vida no hospedeiro intermediário (ovinos ou bovinos e, acidentalmente, o homem) há a formação de um cisto hidático, que abriga a forma pré-adulta do parasito, o protoescólex (PSC), que, ao ser ingerida pelo hospedeiro definitivo (geralmente o cão doméstico), desenvolver-se-á no verme adulto. De outra forma, o cisto primário fértil pode romper-se e extravazar seu conteúdo no interior do hospedeiro intermediário, o que induz os PSCs à formação de cistos hidáticos secundários. Embora existam vários relatos na literatura acerca da utilização de proteínas como biomarcadores para fases de desenvolvimento em outras espécies, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos nessa plasticidade do parasito. Uma opção de estudo está na resposta do parasito a um evento indutor, sendo interessante a marcação de proteínas recém-sintetizadas (PRS), realizada com aminoácidos radioativos ou, mais recentemente, com a utilização de aminoácidos artificiais. Dessa forma, o presente estudo visa melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, através da análise de PRS nos PSCs com a incorporação do aminoácido artificial azido-homoalanina (AHA). Para isso, estudamos diferentes condições para a diferenciação estrobilar de PSCs in vitro e a incorporação de AHA, utilizando um tratamento inicial com pepsina seguido por cultivo em meio bifásico contendo taurocolato. Dessa forma, foi possível visualizar alterações morfológicas características da estrobilização já descritas na literatura, como a diminuição no número de corpúsculos calcários e a formação do canal excretor e bexiga. Após 72 h de incubação dos PSCs em meio bifásico suplementado com AHA, as PRS foram extraídas e marcadas com tetrametilrodamina. A eficiência da incorporação da AHA foi confirmada por SDS-PAGE 12% e visualização com luz ultravioleta, resultando num padrão de bandas complexo, com proteínas de 10 a 225 kDa, sendo este o primeiro relato de marcação e detecção de PRS com AHA em platelmintos.The Echinococcus granulosus is a parasite of Class Cestoda, which causes cystic hydatid disease. During its life cycle in the intermediate host (sheep or cattle and accidentally man), initiates the formation of a hydatid cyst, which contains the pre-adult form of the parasite, the protoescolex (PSC). When ingested by a definitive host (usually the domestic dog), the PSC will develop into the adult worm. Another possibility is the rupture of the primary fertile cyst, releasing PSCs in the intermediate host, which may develop into secondary hydatid cysts. Although there are several reports in the literature about the use of proteins as biomarkers for developmental stages, little is known about the mechanisms involved in the plasticity of E. granulosus. A possible way to study this process is to analyze the parasite response to an inducing event, by labeling newly synthesized proteins (NSP), using radioactive amino acids or, more recently, artificial amino acids. This study aims to better understand the molecular mechanisms involved in the estrobilar development of E. granulosus by analyzing NSP in PSCs with the incorporation of the artificial amino acid azidohomoalanine (AHA). For this purpose, we have used different methods for cultivation that led to the in vitro PSCs’ estrobilar differentiation with an initial pepsin treatment, followed by cultivation in biphasic medium containing taurocholate. Using this procedure, it was possible to observe the morphological changes characteristic of the strobilation stages already described in the literature, such as the decrease in the number of calcareous corpuscles or the visualization of the excretory canal and the bladder. Following incubation of PSCs in biphasic medium supplemented with AHA, the NSP were extracted and labeled with tetramethylrhodamine. The incorporation efficiency of AHA was confirmed by analysis on 12% SDS-PAGE and exposure to UV light, showing a complex pattern of bands, with proteins between 10-225 kDa. This is the first report of labeling and detection of NSP with AHA in flatworms