Purification and immobilization of a protease keratinolytic from Chryseobacterium sp. strain kr6

Queratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) são um grupo de enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise da queratina. A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. kr6 apresenta elevada produção de queratinases extracelulares, demonstrando potencial para bioconversão de substratos constituídos por queratina. O presente trabalho teve como principal objetivo purificar e imobilizar uma queratinase produzida pelo Chryseobacterium sp. kr6. As condições ótimas para a atividade proteolítica da queratinase foram estabelecidas com o auxílo das ferramentas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta. Os resultados demonstraram que tais condições foram atingidas ao utilizar pH na faixa de 7,4 a 9,2, 35°C a 50°C e concentração de NaCl de 50 a 340 mmol L-1. A especificidade da queratinase frente a diferentes substratos também foi investigada, indicando a preferência da enzima por resíduos hidrofóbicos ou positivamente carregados. A completa purificação da queratinase envolveu a precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de permeação em gel e troca aniônica. A amostra obtida após as referidas etapas apresentou um fator de purificação de 40,2 vezes e atividade específica de 21.466 U mg-1 de proteína. A massa molecular da enzima, determinada por SDS-PAGE, foi, de aproximadamente, 20 kDa. Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a inativação térmica da queratinase, sob diferentes condições, foram estimados. A partir dos resultados obtidos, observou-se que a presença de cálcio aumenta significativamente a estabilidade térmica da enzima. Comparando com as amostras controles, o tempo de meia vida da enzima purificada na presença de Ca2+ aumentou 7,3, 20,2 e 9,8 vezes, a 50°C, 55°C e 60ºC, respectivamente. A atividade enzimática foi significativamente inibida na presença de EDTA e 1,10-fenantrolina, sugerindo se tratar de uma metaloprotease. O desenvolvimento de um suporte a base de quitosana para a imobilização covalente da queratinase purificada foi investigado. Para isso, foram avaliados os efeitos de diferentes concentrações de glutaraldeído e tempo de contato deste com as esferas de quitosana, sobre o percentual de imobilização da enzima. Os melhores resultados obtidos para a imobilização da queratinase ao suporte foram ao utilizar concentração de glutaraldeído na faixa de 34 a 56 g L-1 e um período de ativação das esferas na faixa de 6 a 10 h. Sob tais condições, obteve-se 80% de imobilização da enzima. A partir das condições ótimas para a imobilização da enzima ao suporte, apontadas pela metodologia de superfície de resposta, estimou-se a capacidade de carga máxima do suporte, sendo esta de 58,8 U g-1. A enzima imobilizada apresentou maior estabilidade térmica quando comparada com a forma livre, além de reter 63,4% da atividade enzimática inicial após cinco reutilizações.Keratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) are a group of proteolytic enzymes that are able to catalize the keratin hydrolysis. The keratinolytic Chryseobacterium sp. kr6 strain shows high extracellular keratinases production, suggesting potential for bioconversion of keratinous substrates. The present work had as main objective to purify and immobilize a keratinase from Chryseobacterium sp. kr6. The optimal conditions for proteolytic activity were established with aid of experimental design and response surface methodology. The results demonstrated that the best conditions were at pH range of 7.4 to 9.2, 35°C to 50°C and NaCl concentration from 50 to 340 mmol L-1. Keratinase specificity for various substrates also was investigated, suggesting that the enzyme had preference for hydrophobic and positively charged residues. The keratinase purification involved precipitation with ammonium sulphate and chromatographic techniques of gel permeation and anionic exchange. The final sample obtained after the purification steps presents a purification factor of 40.2-fold and specific activity of 21,466 U mg-1 of protein. The molecular weight of the enzyme, determined by SDS-PAGE, was around 20 kDa. The kinetics and thermodynamics parameters for thermal keratinase inactivation, under different conditions, were estimated. From results, it was possible to observe that the calcium affect significantly the thermal stability of the enzyme. Comparing with the control samples, the half-life time of the purified enzyme with calcium increased about 7.3, 20.2 and 9.8-fold, at 50°C, 55°C and 60°C, respectively. The enzyme activity was significantly inhibited in the presence of EDTA and 1,10- phenanthroline, suggesting that the enzyme belongs to metalloprotease group. The developing of a chitosan support for covalent immobilization of the purified keratinase was investigated. The effects of different glutaraldehyde concentrations, as well as, the activation time required for the chitosan beads on the enzyme immobilization were investigated. The optimal conditions for enzyme immobilization were at glutaraldehyde concentration ranging from 34 to 56 g L-1 and activation time of 6 to 10 h. Under these conditions, above 80% of added enzyme was covalently immobilized on the support. From the best conditions, indicated by response surface methodology, the load capacity of the macrospheres was estimated, being of 58.8 U g-1. The immobilized enzyme presented higher thermal stability when compared with free one, besides it retained 63,4% of the initial enzyme activity after five cicles of reuse