Análise molecular dos genes SMN1 e SMN2 em pacientes com suspeita clínica de atrofia muscular espinal

A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME.Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA