Bases moleculares das hemoglobinas variantes e talassemias no Rio Grande do Sul

Hemoglobinopatias são alterações nos genes das globinas que determinam hemoglobinas variantes e/ou talassemias, com manifestações clínicas variáveis em seus portadores. Estudos realizados no Brasil mostram alta prevalência de heterozigotos para Hb S e Hb C, além das talassemias α e β. Considerando-se essa alta frequência populacional e a constituição étnica do sul do país, este trabalho teve como objetivo determinar as bases moleculares das hemoglobinas variantes e talassemias no Rio Grande do Sul. Fizeram parte deste estudo amostras de sangue de recém-nascidos triados pelo Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN), pacientes encaminhados por médicos e serviços de saúde do Estado para investigação de anemia microcítica a esclarecer, pacientes com anemia falciforme e controles afro e eurodescendentes. A identificação e quantificação das frações hemoglobínicas foram realizadas por focalização isoelétrica (FIE) e/ou cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). As principais deleções responsáveis pela talassemia α e os haplótipos do gene β da globina foram determinados por técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR). Quando necessário, foram realizados sequenciamentos dos genes α e β da globina. Dentre as 437.787 amostras de recém-nascidos analisadas, 6.391 (1,46%) apresentaram padrão hemoglobínico alterado: 5.236 FAS, 837 FAC, 199 FAD, 33 FS, 7 FSC, 1 FSD, 7 FS/talassemia β. A incidência das síndromes falciformes foi 1:9.100 nascimentos. Além desses, foram identificados 71 heterozigotos para variantes raras, nos quais foram observadas 26 variantes de cadeia a (3 Hb Woodville, 1 Hb Chad, 2 Hb Hasharon, 4 Hb G-Phil, 4 Hb G-Pest e 12 Hb Stanleyville) e 21 de cadeia b (11 Hb ESakatoon, 1 Hb Osu-Christianborg, 1 Hb Richmond, 2 Hb O-Arab, 1 Hb D Los Angeles, 1 Hb J-Guantanamo, 1 Hb Shelby, 1 Hb Beckman, e 2 Hb Hope). Dentre essas hemoglobinas, 70% estão sendo identificadas pela primeira vez no Brasil, incluindo os 11 casos de Hb E-Saskatoon. A fim de esclarecer esse achado, foram investigados os perfis eletroforéticos e cromatográficos, além da origem genética dos indivíduos portadores dessa hemoglobina através de um estudo de miscigenação e da determinação dos haplótipos do gene de cadeia β. O padrão de migração da FIE foi semelhante ao da Hb E (PI entre 7,59 e 7,65) e o tempo de eluição na HPLC foi na janela da Hb S (4,26- 4,38 min). O estudo de miscigenação mostrou uma alta taxa de contribuição européia (>80%) nesses indivíduos. O haplótipo 2 (+----) foi identificado em todos os portadores de Hb E-Saskatoon. Estes dados sugerem uma origem para esta hemoglobina, diferente da descrita na Turquia, na qual o haplótipo 6 (-++-+) foi observado. Especula-se que esta hemoglobina tenha sido introduzida no Rio Grande do Sul através dos colonizadores da Península Ibérica, uma vez que ela já foi descrita em espanhóis. Do ponto de vista laboratorial, acredita-se que a Hb E-Saskatoon esteja sendo erroneamente diagnosticada, uma vez que a maioria dos laboratórios de triagem neonatal no país aplica apenas uma metodologia (FIE ou HPLC). Em uma população heterogênea do ponto de vista genético, como é a brasileira, sugere-se o uso de ambas as metodologias, além de técnicas de biologia molecular, para a confirmação das hemoglobinas variantes raras. A talassemia a foi investigada em 493 indivíduos não relacionados (202 e 191 controles euro e afrodescendentes, respectivamente) e 101 pacientes com anemia microcítica a esclarecer, com perfil hemoglobínico normal. Apenas a deleção -α3,7 foi observada, com freqüências alélicas de 0,02 e 0,12 entre euro e afrodescendentes e 0,20 em pacientes com anemia a esclarecer. Esses resultados sugerem que a talassemia a, representada pela deleção -α3,7 é uma causa importante de microcitose nas anemias no Sul do Brasil, independente do grupo étnico (p=0,001). Com relação aos haplótipos do gene HBB*S, o haplótipo Bantu foi o mais frequente (67.3%; IC 95%: 60.9 – 73.2), seguido dos haplótipos Benin (25.0%; IC 95%: 19.6- 31.0), Camarões (0.9%; IC 95%: 0.2 – 3.0) e Senegal (0.5%; IC 95%: 0.0- 2.2). O haplótipo Saudi não foi encontrado na amostra. Além desses, 14 cromossomos foram classificados como atípicos. A talassemia alfa foi investigada, sendo que a deleção -α3,7 (única observada) apresentou uma frequência alélica de 0,14. Esses dados mostram não haver aumento dessa deleção em indivíduos homozigotos para Hb S, uma vez que não diferem da frequência encontrada em indivíduos sadios de mesmo grupo étnico (0,12). Com relação aos haplótipos, os dados estão de acordo com os observados nas demais regiões do país, nas quais o haplótipo Bantu é o mais frequente.Hemoglobinopathies are genetic globin gene disorders, characterized by the presence of a variant hemoglobin and/or thalassemia that show a wide range of clinical manifestations. Studies performed in Brazil show high prevalence of Hb S and Hb C heterozygotes as well as α and β thalassemias. Considering the population prevalence and the ethnic constitution of the South Brazilian region, this study aimed to determine the molecular basis of the variant hemoglobins and thalassemia in Rio Grande do Sul. The analyses included blood samples from neonates selected by the Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN), patients under investigation of microcytic anemia, sickle cell anemia patients and control groups of African and European descent. The identification and quantification of hemoglobin were performed using isoeletric focusing (IEF) and/or cation exchange high performance liquid chromatography (HPLC). The most common deletions resulting in a thalassemia and the haplotypes for β globin gene were determined by PCR based methods. When necessary, sequencing was performed for α and β globin genes. Among the 437,787 neonates samples analyzed, 6,391 (1.46%) presented an abnormal hemoglobin pattern: 5,236 FAS, 837 FAC, 199 FAD, 33 FS, 7 FSC, 1 FSD, 7 FS/β thalassemia. Incidence of sickle cell disease was 1:9,100 births. Furthermore, 71 individuals heterozygous for rare variants were observed: 26 α chain variants (3 Hb Woodville, 1 Hb Chad, 2 Hb Hasharon, 4 Hb G-Phil, 4 Hb G-Pest, and 12 Hb Stanleyville) and 21 β chain variants (11 Hb E-Sakatoon, 1 Hb Osu-Christianborg, 1 Hb Richmond, 2 Hb O-Arab, 1 Hb D Los Angeles, 1 Hb J-Guantanamo, 1 Hb Shelby, 1 Hb Beckman, and 2 Hb Hope). Seventy per cent of these rare hemoglobins were identified for the first time in Brazil, including 11 individuals heterozygous for Hb E-Saskatoon. In order to further analyze this data, electrophoretic and chromatographic profiles were investigated, as well as the genetic origin of the carriers of this hemoglobin, through an admixture study and b-globin haplotype determination. The FIE migration pattern was similar to Hb E (PI between 7.59 and 7.65) and the elution pattern in HPLC was in the Hb S window (4.26-4.38 min). The admixture study indicated a high European contribution (>80%) in these individuals. Haplotype 2 (+----) was identified in all Hb ESaskatoon carriers. These data suggest a origin for this hemoglobin, distinct from that described in Turkey, where haplotype 6 (-++-+) was observed. It can be speculated that this hemoglobin was brought to Rio Grande do Sul by immigrants from Iberian Peninsula, since it has been described in Spaniards. We believe that Hb E-Saskatoon has been erroneously diagnosed, because most neonatal laboratories use only one methodology (FIE or HPLC). In a genetic heterogeneous population, as Brazilians, we suggest the use of both methodologies, together with molecular techniques to a precise identification of hemoglobin variants. α thalassemia was investigated in 493 unrelated individuals (202 and 191 European and African descendants, respectively) and in 101 patients with microcytic anemia with normal Hb profile. Only -α3.7 deletion was observed, presenting allelic frequencies of 0.02 and 0.12, respectively, in European and African descendants and of 0.20 in patients with microcytic anemia. These results suggest that a thalassemia, represented here by -α3.7 deletion, is an important cause for microcytosis in South Brazil, independently of ethnic origin (p=0.001). With regard to HBB*S haplotypes, Bantu haplotype was the most frequent (67.3%; CI 95%: 60.9 – 73.2), followed by Benin (25.0%; CI 95%: 19.6- 31.0), Camaroon (0.9%; CI 95%: 0.2 – 3.0) and Senegal haplotypes (0.5%; CI 95%: 0.0- 2.2). The Saudi haplotype was not observed in this sample. Fourteen chromosomes classified as atypical were observed. a thalassemia was also investigated and the -α3,7 deletion was the only a-thalassemia determinant observed. The frequency of this allele was estimated as 0.14. These data indicate that the frequency of this deletion in homozygous Hb S individuals is not different from that observed in the control group with the same ethnic origin (0.12). The data concur with previously published data from Brazilian regions. The Bantu haplotype is the most common in all Brazilian regions