Produção de vetores de transformação de plantas contendo fusões das proteínas ASR (Abcisic acid, Stress and Ripening) e GFP (Green Fluorescent Protein) visando a determinação da localização subcelular das proteínas ASR de arroz (Oryza sativa L.)

Os genes ASR (ABA, Stress and Ripening) foram descritos, inicialmente, em tomate (Solanum lycopersicum) e, em seguida, identificados em diversas espécies de plantas. A expressão dos genes ASR é induzida por ácido abscísico (ABA) e seus níveis de transcritos são rapidamente aumentados em resposta à salinidade e à seca. Estudos de localização subcelular mostraram que as proteínas ASR localizam-se no núcleo onde regulam promotores específicos, indicando que estas proteínas atuam como fatores de transcrição e que, provavelmente, ligam-se a promotores de genes de transportadores de hexoses e genes responsivos à ABA. Em tomate, foi demonstrado a localização citoplasmática de uma parcela das proteínas ASR1 que desempenham um importante papel na proteção contra a desnaturação e agregação protéica causadas por estresses abióticos. Em arroz (Oryza sativa), análises in silico revelaram a presença de seis cópias de genes ASR, dispersas em diferentes cromossomos. Dados de localização subcelular demonstraram a localização nuclear e citoplasmática da proteína ASR5 de arroz. No entanto, a localização subcelular das demais proteínas ASR de arroz ainda não foi determinada. O objetivo deste trabalho foi produzir vetores de transformação de plantas contendo fusões das proteínas ASR e GFP (Green Fluorescent Protein) visando a determinação da localização subcelular das proteínas ASR de arroz. Os genes OsASR foram amplificados por PCR utilizando-se como molde cDNA produzido a partir de RNA de folhas de arroz. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de entrada pENTR. Os plasmídeos pENTR/OsASR foram utilizados para recombinação com o vetor de localização subcelular pH7FWG2/UBI; obtido neste trabalho pela substituição do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, pelo promotor da ubiquitina do milho no vetor pH7FWG2. As clonagens foram confirmadas por PCR utilizando primers específicos para cada gene OsASR e para o gene Hpt (gene que confere resistência à higromicina), presente no plasmídeo pH7FWG2/UBI. Foram obtidos plasmídeos binários contendo fusões com GFP que serão usados como vetores de transformação portando os genes OsASR1, OsASR2, OsASR4 e OsASR5. Estes vetores de expressão foram transferidos para Agrobacterium tumefasciens, a qual está sendo utilizada para transformação genética de calos embriogênicos de arroz para estudo de localização subcelular. Os dados de localização subcelular das proteínas ASR poderão contribuir para inferir as possíveis funções que estas proteínas exercem na célula vegetal