Isolamento e caracterização do gene emp1 de Metarhizium anisopliae e ensaios de indução da diferenciação de apressório

Durante o processo de infecção, o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae desenvolve uma estrutura especializada denominada apressório. Essa estrutura é responsável por realizar pressão de turgor sobre a cutícula do hospedeiro para auxiliar na transposição desta barreira e instalar a infecção. Neste trabalho, a diferenciação de apressório foi induzida através de cultivo de conídios sobre lamínulas de vidro na presença de extrato de levedura como fonte de nitrogênio. As melhores condições de cultivos determinadas foram de um meio contendo 0,0040% de extrato de levedura, concentrações de conídios por lamínula entre 2,5.105 e 5.105 e tempo de cultivo de 16 horas a 28C. A sequência genômica de emp1 foi isolada e apresentou uma ORF de 803 nucleotídeos codificando uma proteína predita de 226 aminoácidos. A proteína predita contém uma região N-terminal contendo um peptídeo sinal para secreção, um sítio potencial de N-glicosilação, 16 aminoácidos na porção C-terminal característicos de sítios de adição de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A massa molecular da proteína predita foi de 22KDa com um pI de 5,5. A sequência de emp1 apresentou homologia com os genes das proteínas de matriz extracelular de Fusarium oxysporum (gene fem1) e de Magnaporthe grisea (gene emp1). Com base na sequência de emp1 de M. anisopliae um vetor de disrupção foi construído e a seleção inicial dos transformantes foi conduzida.The entomopathogenic fungi Metharhizium anisopliae develops specialized infection structures known as appressorium wich trigger turgor pressure that is crucial for host penetration. In this work, the appressorium differentiation was induced in glass coverslips and the best nutritional condition (0.004% of yeast extract), time of growth (16 hours) and conidia concentration between 2.5.105 and 5.105 were optimized. Genomic DNA sequence of M. anisopliae emp1 showing sequence homology to an extracellular matrix protein gene fem1 of Fusarium oxysporum and emp1 of Magnaporthe grisea was isolated. This sequence presents an open reading frame of 803 nucleotides encoding a predicted protein of 226 amino acids. The estimated molecular weight of the predicted protein product was 22 KDa with a pI of 5.5. It contains amino acid N-terminal secretion signal sequence, as well a potential N-glycosylation site. At its C-terminus, the protein contains a 16 amino acid sequence showing characteristics of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor addition signal. Based on this sequence a disruption vector was constructed with the bar cassette, allowing initial selections of mutants