Avaliação da captação do íon metálico Sn2+ e seus efeitos tóxicos e genotóxicos em células eucarióticas

A resistência ao cloreto estanoso (SnCl2) nas células eucarióticas de levedura Saccharomyces cerevisiae é um produto de vários processos metabólicos. O mutante rad52 , deficiente no mecanismo de reparação recombinacional, incapaz de reparar quebras simples e duplas no DNA, foi o mais sensível ao íon metálico Sn²+. A resistência relativa dos mutantes rad e rad4 , deficientes na reparação por excisão de nucleotídeos (NER), mostrou-se significativamente elevada, indicando a participação dessa via na reparação dos danos causados pelo SnCl2. Uma série de mutantes defectivos na via de reparação por excisão de bases (BER), combinada com mutantes defectivos em NER, foi utilizada para determinar indiretamente o tipo de lesão causada pelo SnCl2 ao DNA. A DNA N-glicosilase (Ntg2p) mostrou-se, por sua vez, indispensável à reparação das lesões ao DNA induzidas pelo íon metálico Sn²+. A ausência do fator de transcrição Yap1, responsável pela resposta ao estresse oxidativo em leveduras, ocasionou o aumento da sensibilidade ao íon metálico Sn²+. Além disso, a sensibilidade dos mutantes sod1 e sod2 revelou a importância das enzimas antioxidantes Sod1p e Sod2p na resposta aos danos gerados pelo íon metálico Sn²+. A sensibilidade mais elevada ao SnCl2 foi observada quando as células estavam na fase exponencial de crescimento (fase LOG), o que sugere que há dois sistemas independentes (um mediado pela repressão/desrepressão catabólica, e outro, pela ativação da transcrição de genes envolvidos nas vias de defesa contra espécies reativas de oxigênio (EROs)), que atuam em conjunto e contribuem para a resistência aos danos causados pelo íon metálico Sn²+. Para determinar a concentração do íon metálico Sn²+ captada nas células da levedura S. cerevisiae e correlacioná-la com a toxicidade desse íon metálico, foi determinado o conteúdo de metal intracelular pelo método de Emissão de Raios-X Induzida por Partículas Carregadas, ou Particle Induced XRay Emission (PIXE), desenvolvendo-se um protocolo para as análises. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem diplóide XS2316 captou 60% da quantidade total do íon metálico Sn²+, captada pela linhagem haplóide XV184-14c. Isso indica que a linhagem haplóide capta maior quantidade do íon metálico Sn²+ do que a linhagem diplóide, o que pode explicar a citotoxicidade diferenciada de ambas as linhagens quando tratadas com SnCl2. Por fim, utilizando-se a mesma metodologia, foi realizada uma análise multielementar para avaliar se havia uma interação entre o íon metálico Sn²+ e outros elementos químicos essenciais para a célula. De acordo com as análises por PIXE, após tratamento com SnCl2, a linhagem haplóide XV185-14c apresentou um decréscimo significativo nas quantidades de Mg, Zn, S e Fe, e, por outro lado, um aumento na quantidade de P. Para verificar como o íon metálico Sn²+ é captado, distribuído e destoxificado, foram associadas técnicas moleculares, incluindo ensaios de citotoxicidade e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), com a metodologia do PIXE. Os ensaios de sobrevivência mostraram que Fet4 e Zrt2, ambas proteínas de transporte de baixa afinidade do ferro e zinco, respectivamente, podem internalizar o íon metálico Sn²+. Por sua vez, qRT-PCR mostrou um aumento da expressão gênica de CCH1 e MID1, os quais codificam as proteínas Cch1 e Mid1, envolvidas no transporte de Ca²+ na membrana plasmática, sugerindo que essas duas proteínas também podem estar envolvidas na captação do íon metálico Sn²+. Os resultados indicaram que, uma vez dentro da célula, o íon metálico Sn²+ pode ser armazenado no vacúolo através da ação da proteína P-type ATPase Pmc1 e quelado no citoplasma pela metalotioneína Crs5. Alternativamente, o íon metálico Sn²+ pode gerar EROs, em especial o ânion superóxido (O2 -), o qual pode ser dismutado pela proteína Sod1, formando peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (.OH). Consequentemente, as EROs podem induzir a transcrição de vários genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo, como SOD1, YAP1 e APN1. Para elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na genotoxicidade do íon metálico Sn²+, foi avaliada a indução de quebras causadas pelo SnCl2 na presença de formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (ENDO III), bem como a interferência desse íon na reparação das lesões induzidas pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) em células de pulmão de hamster chinês (V79) pelo ensaio cometa. Os resultados mostraram que, em concentrações tóxicas, o íon metálico Sn²+ induziu somente uma limitada elevação nos sítios sensíveis de FPG e ENDO III, sugerindo que o íon metálico Sn²+ preferencialmente não induz lesões oxidativas nas bases nitrogenadas. Embora a concentração de 50 μM de SnCl2 não tenha produzido um aumento significativo na quantidade de danos ao DNA, ela foi capaz de inibir a reparação dos danos provocados pelo agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS) durante o período de pós-tratamento de 24h. Os resultados demonstraram o efeito genotóxico e comutagênico do SnCl2 em células V79. O efeito inibitório do íon metálico Sn²+ na reparação dos danos induzidos pelo MMS no DNA sugeriu que esse metal também pode interferir em sistemas de reparação do DNA, que contribuem para o aumento de mutações pela alteração do equilíbrio entre o processo de reparação livre de erro e o sujeito a erro.Resistance to stannous chloride (SnCl2) of the yeast Saccharomyces cerevisiae is a product of several metabolic pathways of this unicellular eukaryote. The recombination deficient rad52 mutant, unable to repair DNA single and double strand breaks was the most sensitive. The relative resistance of mutant strains rad2 e rad, deficient in nucleotide excision repair (NER), was rather high, indicating a minor but significant contribution to repair of Sn²+ -induced DNA lesions by this repair pathway. A series of mutants defective in different base excision repair (BER) pathway, combined with NER were used to indirectly determine the type of SnCl2-produced DNA lesion. The Ntg2p DNA N-glycosylase seems to be indispensable for repair of Sn²+ -induced DNA lesions. Lack of transcription factor Yap1p, responsible for the oxidative stress response in yeast, led to increase in Sn²+ -sensitivity. In addition, sensitivity of the superoxide dismutase mutants sod1 and sod2 revealed the importance of these anti-oxidative defence enzymes against Sn²+ -imposed DNA damage. The highest SnCl2 -sensitivity, however, was observed in glucose-repressed pre-diauxic shift exponentially growing cells (LOG cells). It has been suggested that two independently acting anti-ROS protective systems (one mediated by glucose repression/de-repression, the other via ROS-inducible transcription activators) are working together, and that both contribute to Sn²+ -resistance. To determine the concentration of Sn²+ ions cells of the S. cerevisiae and to correlate their quantity with the toxicity, the intracellular metal content of yeast cells was determined by Particle Induced X-ray emission (PIXE). A thick target protocol was developed for PIXE analysis. The PIXE analysis suggested that diploid (XS2316) cells absorbed about 60% of the total amount of Sn²+ absorbed by the haploid (XV185-14c) yeast cells. This indicates that Sn²+ absorption is better in haploid yeast cells and agrees well with published toxicity results. Finally, we performed a screening in order to know the putative interactions between Sn²+ and other essential elements. According to PIXE analysis, the results for XV185-14c yeast cells indicate a significant loss of intracellular elements such as Mg, Zn, S, Fe and an increase of P levels after 1 h exposure to 25 mM SnCl2 in STAT phase. In order to verify how Sn²+ is uptaken, distributed and detoxified, we associated molecular techniques including survival assay and quantitative real time PCR (qRT-PCR) with PIXE. The survival assay showed that Fet4p and Zrt2p both low-affinity iron and zinc transporters, respectively, may internalize Sn²+. By its turn, qRT-PCR showed an increased in CCH1 and MID1 gene expression, which encode for the cytoplasmic transmembrane Ca²+ transporters Cch1p and Mid1p, suggesting that both proteins may also take up Sn²+. Our data also indicated that once inside the cell, Sn²+ may be taken up from the cytosol by a P-type ATPase to the vacuole (Pmc1p) or may be chelated by Crs5p metallothionein in the cytosol. Alternatively, Sn²+ may generate reactive oxygen species (ROS), especially O2 - which can be dismutate to form H2O2 and the highly reactive OH. In consequence, ROS can induce cellular injury and stress-generated activation of many genes, e.g., SOD1, YAP1, and APN1. In order to clarify the molecular mechanisms of Sn²+ genotoxicity, we evaluated the induction of strand breaks, FPG and ENDO III sensitive sites, and the interference with the repair of MMS-caused DNA damage in V79 Chinese hamster lung fibroblasts exposed to stannous chloride by comet assay. Our results demonstrated that Sn²+ induced only a limited elevation in FPG and ENDO III sensitive sites in toxic concentrations. This suggests that stannous ion does not preferentially induce base modifications that are the substrate of FPG and ENDO III enzymes in V79 cells. Although 50 µM SnCl2 concentration did not increase significantly the DNA migration by itself in comet assay, it was capable to inhibit the repair of MMSinduced DNA damage during the pos-treatment period of 24h. Our results demonstrate the genotoxic and comutagenic effects of stannous chloride in V79 cells. The inhibitory effect of Sn²+ on repair of MMS-induced DNA damage suggests that this metal can also interfere in DNA repair systems thus contributing to increased mutation by shifting the balance from error-free to error-prone repair processes