Efeito inseticida de proteínas inativadoras de ribossomo tipo 1 e do Jaburetox-2Ec em lipidópteros

As plantas possuem um arsenal de substâncias utilizadas como defesa contra patógenos e predadores. A possibilidade de utilizar tais substâncias como biopesticidas revolucionou o estudo das proteínas tóxicas. Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e as ureases estão entre as proteínas que são abundantes em plantas. RIPs tipo 2 como a ricina, são muito tóxicas, e podem despurinar ribossomos de várias espécies e induzir lesão em DNA, levando à interrupção da síntese protéica e morte de células. Menos tóxicas que a ricina, a maior parte das RIPs conhecidas são do tipo 1 com apenas uma cadeia polipeptídica de 25 - 32 kDa. As ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. A semente do feijão-de-porco, Canavalia ensiformis, é fonte rica de isoformas de urease, entre elas, a canatoxina (CNTX). A proteína CNTX apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos, e sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10kDa (pepcanatox), que ocorre por ação das catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Um peptídeo equivalente ao pepcanatox foi obtido por expressão heteróloga em Escherichia coli - Jaburetox-2Ec, o qual apresentou atividade tóxica contra Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Blatella germanica. Nesse trabalho demonstramos a atividade inseticida de cinco RIPs tipo 1 (PAP-S, gelonina, momordina, saporina-S6 e licnina) em Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis. As RIPs mostraram um efeito entomotóxico espécie-específico para as lagartas, sendo que momordina foi a menos tóxica nos bioensaios. Perda de peso mais pronunciada foi observada em S. frugiperda no 4° dia após o início dos ensaios e para a A. gemmatalis, no 10° dia. A indução da mortalidade (larval e/ou pupal) foi de 57,13% para os tratamentos em A. gemmatalis e 29,45% para S. frugiperda. Para investigar o efeito deterrente de RIPs tipo 1 em insetos, verificou-se, através do teste cometa, o nível de danos ao DNA em tecidos de S. frugiperda e A. gemmatalis que ingeriram um total de 40 μg de RIPs. Os insetos tratados com RIPs mostraram um valor 2 a 3 vezes maior de células com sinais de dano de DNA do que o controle. O dano de DNA poderia ser conseqüência do estresse oxidativo, assim analisou-se atividade de enzimas antioxidantes CAT e SOD e níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nos extratos celulares dos insetos, mas não houve uma correlação entre dano de DNA e marcadores de estresse oxidativo. O peptídeo recombinante derivado de urease, jaburetox-2Ec, induziu uma mortalidade de 100% de S. frugiperda após ingestão de 47μg do peptídeo. Em contraste com os dados obtidos com as RIPs, o jaburetox-2Ec não causou lesões no DNA ou alterações em marcadores do balanço redox em S. frugiperda evidenciando um mecanismo de ação distinto. Em linhagens de células de insetos em cultura (Tn5B e UFL-AG-286), a análise citomorfológica sugeriu a ocorrência de citotoxicidade e lise celular com exposição a 80 e 10 μg do jaburetox-2Ec, após 4 e 7 dias de incubação, respectivamente. Para compreender a ação do peptídeo entomotóxico em células de insetos, realizou-se testes de citotoxicidade utilizando o kit CyTotox-GloP TM P incubando-se células UFL-AG-286 e Sf21 com jaburetox-2Ec. Os resultados com esse kit não foram conclusivos, sugerindo que o peptídeo recombinante seria capaz de inibir as proteases intracelulares liberadas na lise celular. Nossos resultados mostraram que RIPs tipo 1 e o jaburetox-2Ec têm efeito inseticida em lepidópteros por mecanismos distintos, sendo que as RIPs tipo 1 induzem lesão de DNA em A. gemmatalis e S. frugiperda, enquanto que jaburetox-2Ec induz alterações ainda não identificadas, que resultam em morte do inseto.The plants have an arsenal of substances used as a defense against pathogens and predators. The possibility of using these substances as biopesticides revolutionized the study of toxic proteins. Ribosomes-inactivating proteins (RIPs) and ureases are among the proteins that are abundant in plants. Type 2 RIPS, such as ricin, are highly toxic and depurinate ribosomes of different species and induce DNA damage, arresting protein synthesis and leading to cell death. Less toxic, most of the known RIPs are type 1, composed of a single polypeptide chain of 25-32 kDa. Ureases (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. The seed of jackbean (Canavalia ensiformis) is a rich source of ureases isoforms, one of which is canatoxin (CNTX). The protein CNTX presents insecticidal activity and its toxicity relies on an internal ~10 kDa peptide (pepcanatox) released upon hydrolysis of CNTX by digestive cathepsins of susceptible insects. A peptide equivalent to pepcanatox obtained by heterologous expression in Escherichia coli - Jaburetox-2EC, showed insecticidal activity against Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Blatella germanica. In this study we demonstrated the insecticidal activity of five type 1 RIPs (PAP-S, gelonin, momordin, saporin-S6 and lychnin) in Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis. The entomotoxic effect of RIPs was species-specific and momordin was shown to be the less toxic in the bioassays. S. frugiperda had a more pronounced weight loss on the 4th day of treatment and A. gemmatalis on the 10th day. Mortality (larval and/or pupal) rate reached 57.13% for A. gemmatalis and 29.45% for S. frugiperda. To investigate the deterrent effect of type 1 RIPs in insects, the levels of DNA damage were evaluated using the comet test in tissues homogenates of S. frugiperda and A. gemmatalis fed a total of 40μg of RIPs. The RIPs-treated insects showed 2 to 3 times more cells with DNA damage, as compared to controls. To test whether DNA damage could be consequent to oxidative stress, the activity of the antioxidant enzymes SOD and CAT and levels of lipid peroxidation (TBARS) were assayed in cellular extracts of S. frugiperda and A. gemmatalis fed 40 μg RIPs, but no correlations were found between DNA damage and stress markers. The urease-derived recombinant peptide, jaburetox-2Ec, induced 100% mortality of S. frugiperda fed 47 μg peptide. In contrast to the results observed for type 1 RIPs, treatment of S. frugiperda with jaburetox-2Ec did not cause damage in DNA nor modifications in redox balance markers, indicating a distinct mechanism of action. Microscopic analysis of lepidopteran insect cells in culture (lines Tn5B and UFL-AG-286) suggested cytotoxicity and cell lysis induced by incubation with 80 and 10 μg jaburetox- 2Ec, after 4 and 7 days, respectively. Aiming to understand the mode of action of the entomotoxic peptide in insects cells, the CyTotox-GloP TM Pkit was used to detect cytotoxicity in UFL-AG-286 and Sf21 cells incubated with jaburetox-2Ec. Unexpectedly, the results were not conclusive since it appears that the recombinant peptide is able to inhibit the intracellular proteases released upon cell lysis, preventing the hydrolysis of fluorogenic substrate used in the kit. In conclusion, our results demonstrated that type 1 RIPs and jaburetox-2Ec are insecticidal to lepidopterans acting through distinct mechanisms. Thus type 1 RIPs induce DNA damage in A. gemmatalis and S. frugiperda, while jaburetox-2Ec induce yet to be identified physiological changes that lead to insect death