Estudo da expressão e características bioquímicas das ectonucleotidases em cultura de células acinares de glândulas salivares

Os nucleotídeos da adenina são moléculas sinalizadoras no meio extracelular e estão envolvidas em importantes condições fisiológicas e patológicas. O papel do ATP como um mediador extracelular e neurotransmissor têm sido descrito em vários sistemas, inclusive na glândula salivar. Nas glândulas salivares, o ATP é liberado juntamente com acetilcolina e noradrenalina a partir do sistema de inervação da glândula. Esse ATP atua sobre os receptores P2X4, P2X7, P2Y1 e P2Y2, regulando importantes processos secretórios. Os eventos induzidos pelos nucleotídeos extracelulares são controlados pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases), ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPPs) e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos a presença dessas ectonucleotidases nas células acinares da glândula submandibular. A presença de uma E-NTPDase e uma ecto-5'-nucleotidase foi identificada com as seguintes propriedades bioquímicas para a hidrólise de ATP, ADP e AMP: pH ótimo entre 6,5-8,0, requerimento de cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e valores de Kmapp na faixa de micromolar. As células acinares das glândulas salivares também foram capazes de hidrolisar o p-Nph-5´-TMP, sugerindo a presença de uma E-NPP. A enzima descrita nesse estudo é dependente de cátions metálicos divalentes (Ca+2 e Mg+2), sendo que a hidrólise do p-Nph-5´-TMP foi máxima na presença de níveis basais de cátions e em pH entre 8,5 e 9,0. Também se analisou o efeito de vários compostos sobre a hidrólise do ATP, ADP e p-Nph-5´-TMP e verificou-se que aazida sódica, inibidor de várias NTPDases, inibiu a hidrólise do ATP e do ADP, e não teve efeito sobre o p-Nph-5´-TMP.A ouabaína e o NEM, inibidores clássicos de ATPases, não afetaram significativamente a hidrólise de ATP, ADP e p-Nph-5´- TMP, já o AMP, inibiu a hidrólise do p-Nph-5´-TMP. Esses resultados sugerem a co-existência de diferentes ectonucleotidases nas células acinares, que estão relacionadas com a hidrólise dos nucleotídeos e que podem atuar em diferentes situações. Também avaliamos o efeito de fármacos antidepressivos na atividade e expressão das enzimas envolvidas na hidrólise dos nucleotídeos. Em relação à atividade enzimática, observamos que a fluoxetina induziu um aumento na hidrólise de ATP e ADP e o moclobemide e a imipramina induziram um aumento significativo na hidrólise de todos os nucleotídeos (ATP, ADP e AMP). A expressão relativa da NTPDase1-3 aumentou e da ecto-5´-nucleotidase diminuiu com a imipramina. A fluoxetina aumentou a expressão relativa da NTPDase3 e ecto-5´-nucleotidase e inibiu a expressão relativa da NTPDase2. O moclobemide aumentou a expressão relativa de todas as enzimas. Em relação à atividade enzimática da NPP, os tratamentos com imipramina, fluoxetina e moclobemide levaram a um aumento significativo dessa atividade, enquanto as expressões relativas das NPP-1, NPP-2 e NPP-3 não apresentaram alteração. A presença de ectonucleotidases modulando os níveis dos nucleotídeos nas células acinares é importante tendo em vista o papel do ATP nos mecanismos de secreção salivar.Adenine nucleotides are extracellular signaling molecules and are involved in important physiological and pathological conditions. The role of adenosine triphosphate (ATP) as an extracellular mediator and neurotransmitter has been described in various systems, including salivary glands. In salivary glands, extracellular ATP is co-released with acetylcholine and noradrenaline from glands nerve system. ATP acts on P2X4, P2X7, P2Y1 e P2Y2 receptors and may regulate important secretory processes in salivary gland cells. The events induced by extracellular nucleotides are controlled by ectonucleotidases, that include family members of ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase), ectopyrophosphatases/ phosphodiesterases (E-NPP) and ecto-5’-nucleotidase. The presence of an E-NTPDase and ecto-5'-nucleotidase was identified with the following biochemical characteristics for ATP, ADP, and AMP hydrolysis: optimum pH between 6.5-8.0, dependence of divalent cations (Ca2+ e Mg2+) and Kmapp values in micromolar range. Acinar cells from salivary glands were capable to hydrolyze p-Nph-5´-TMP, suggesting the presence of an E-NPP. The enzyme described in this study is divalent cations-dependent (Ca+2 e Mg+2), and the p-Nph- 5´-TMP hydrolysis was maximal with basal levels of cations in pH between 8,5 and 9,0. The effect of different compounds in ATP, ADP e p-Nph-5´-TMP hydrolysis was evaluated and sodium azide, an inhibitor of several NTPDases, inhibited ATP and ADP hydrolysis, but have no effect in p-Nph-5´-TMP hydrolysis. Ouabain, NEM, classical ATPases inhibitors did not affect ATP, ADP e p-Nph-5´-TMPhydrolysis; however, AMP inhibited the p-Nph-5´-TMP hydrolysis. These results suggest the co-existence of different ectonucleotidases in acinar cells that are related with nucleotide hydrolysis and can act under different situations. The effect of antidepressants in activity and expression of enzymes involved in nucleotide hydrolysis was also evaluated. In relation to enzymatic activity, fluoxetine induced an increase only in ATP and ADP hydrolysis, whereas moclobemide and imipramine induced a significant increase in hydrolysis of all nucleotides (ATP, ADP and AMP). The relative expression of NTPDase1-3 was enhanced and for ecto-5´-nucleotidase was diminished with imipramine. Fluoxetine enhanced relative expression of NTPDase3 and ecto-5´-nucleotidase and inhibited the relative expression of NTPDase2. Moclobemide enhanced the relative expression of all enzymes. In relation to E-NPPs activities, imipramine, fluoxetine e moclobemide treatmens lead to a significant increase in this activity whereas the relative expression of NPP-1, NPP-2, and NPP-3 did not show modifications. The presence of ectonucleotidases modulating the levels of nucleotides in acinar cells is important considering the ATP role in the mechanisms of salivary secretion