Identifikasi Mikroba Indigen Penghasil Alkaline Protease Berdasarkan Urutan Basa Gen Pengkode 16S rRNA

ABSTRAK Yuliatin, 2013. Identifikasi Mikroba Indigen Penghasil Alkaline Protease Berdasarkan Urutan Basa Gen Pengkode 16S rRNA. Skripsi. Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang. Pembimbing (I) Dr. Suharti, S.Pd, M.Si, (II) Eli Hendrik Sanjaya, M. Si Kata Kunci: alkaline protease, 16S rRNA, PCR, sequencing Uji fenotipe bakteri indigen penghasil alkaline protease yang telah diisolasi dari feses ayam Broiler mengindikasikan bahwa bakteri tersebut merupakan Proteus sp. yang berasal dari famili Enterobacteriaceae dari klas Gammaproteobacteria. Padahal Proteus sp. merupakan bakteri patogen, oleh karena itu diperlukan uji genotipe berdasarkan urutan DNA pengkode 16S rRNA untuk mengkonfirmasi hasil tersebut. Penelitian ini bersifat deskriptif laboratoris. Tujuan penelitian yaitu mengetahui spesies bakteri tersebut berdasarkan urutan gen pengkode 16S rRNA. Metode yang digunakan adalah isolasi dan pengukuran kosentrasi DNA total bakteri, amplifikasi dengan PCR, elektroforesis, sequencing, dan analisis bioinformatika. DNA genom diamplifikasi pada daerah DNA pengkode 16S rRNA dengan PCR menggunakan primer universal 63f dan 1387r. Proses amplifikasi dimulai dengan pre denaturation pada 94oC selama 2 menit, dilanjutkan siklus denaturation, annealing, dan extention berturut-turut 94oC selama 30 detik, 55ºC selama 40 detik dan 72ºC selama 30 detik berlangsung sebanyak 30 siklus. Tahapan amplifikasi diakhiri dengan final extension pada suhu 72ºC selama 5 menit. Hasil amplifikasi divisualisasikan dengan elektroforesis mengunakan agarose 1%. DNA hasil amplifikasi selanjutnya di-sequencing mengunakan primer yang sama menggunakan genetic analyzer ABI PRISM 310. Urutan basa DNA selanjutnya di-BLAST pada situs NCBI dan dianalisis dengan program ClustralX untuk mengetahui hubungan kekerabatan bakteri. Selanjutnya dibuat pohon filogenetik dengan program MEGA versi 5.03. Metode statistik yang digunakan adalah Neighbor-Joining Tree dengan model p-distances tingkat 1000 bootstrap. Hasil pengukuran dengan nano drop menunjukkan kosentrasi isolat DNA yaitu 399,0 ng/µL. Visualisasi hasil amplifikasi menggunakan elekroforesis menunjukkan adanya pita tunggal DNA dengan ukuran sesuai yang diharapkan yaitu sekitar 1,3 kb. Hasil sequencing menunjukkan bahwa fragmen DNA yang berhasil ditentukan urutan nukleotidanya sepanjang 1,209 kb. Hasil analisis dengan bioinformatika menunjukkan bakteri yang dianalisis mempunyai tingkat kekerabatan terdekat dengan genus Acetobacter dengan tingat kemiripan sebesar 88%, sedangkan kemiripannya dengan bakteri dari genus Proteus sebesar 71%. Diperlukan sequencing yang lebih akurat untuk mengetahui kemungkinannya sebagai spesies baru