Identifikasi Bakteri Indigen Penghasil Protease Ekstraseluler melalui Analisis Gen Pengkode 16S rRNA

ABSTRAK   Sulistyani, N. 2013. Identifikasi Bakteri Indigen Penghasil Protease Ekstraseluler melalui Analisis Gen Pengkode 16S rRNA. Skripsi, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang. Pembimbing (I) Dr. Suharti, S. Pd., M. Si, (II) Eli Hendrik Sanjaya, S. Si., M.Si.   Kata Kunci : Protease, identifikasi molekuler, 16S rRNA, dan filogenetik. Pada penelitian sebelumnya telah berhasil diisolasi bakteri indigen penghasil protease dari air yang disebut isolat NS. Uji fenotip menunjukkan bahwa isolat tersebut adalahAeromonas hydrophila. Untuk menentukan spesies bakteri tersebut secara lebih akurat, perlu dilakukan analisis urutan gen pengkode 16S rRNA. Penelitian ini dimulai dengan tahap awal yaitu isolasi DNA dari sel dan hasil isolasi DNA dianalisis dengan menggunakan Spektrofotometer NanoDrop. Fragmen DNA gen pengkode 16S rRNA selanjutnya diperbanyak menggunakan primer 63F-1387R dan 536F-1392R yang masing-masing mampu memperbanyak fragmen dengan ukuran 1300 bp dan 900 bp. Proses ini dilakukan melalui beberapa tahapan yang dimulai dengan denaturasi awal pada 94℃ selama 5 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus yang meliputi 3 tahapan yaitudenaturation pada 94℃ selama 1 menit, annealing pada 50℃ selama 1 menit dan extention pada 72 ℃ selama 2 menit, dan diakhiri dengan final extention pada 72 ℃ selama 10 menit. Hasil PCRdianalisis menggunakan elektroforesis, selanjutnya sekuensing menggunakan ABI PRISM 310 Genetik Analyzer. Urutan basa nukleotida yang diperoleh dianalisis menggunakan program BLAST pada bank data di situs NCBI. Penentuan kekerabatan dengan bakteri laindilakukan menggunakan program clustalX ver 2.0.12. Penyusunan pohon filogenetik dilakukan melalui program MEGA ver. 5.03 dengan metode statistik Neighbor-Joining Tree dengan model p-distance tingkat 1000 boostrap. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil isolasi DNA berisi 1759,3 ng/μL. Hasil PCR menunjukkan adanya pita tunggal dengan ukuran sekitar 900 bp. Hasil sekuensing fragmen tersebutmenghasilkan sekuen sebesar 726 bp.Analisis bioinformatika menggunakan program BLAST menunjukkan bahwa isolat NS memiliki tingkat identitas maksimum sebesar 87% dengan Pseudomonas stutzeri. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat tersebut bukan merupakan Aeromonas hydrophila, namun juga bukan merupakan Pseudomonas stutzerikarena tingkat similaritasnya kurang dari 97%. Dengan demikian dapat diduga bahwa isolat NS merupakan spesies baru, sehingga perlu penelitian lanjutan dengan mensekuensing seluruh gen pengkode 16S rRNA isolat NS