Identificación de las especies del género Mycobacterium mediante proteómica

Background: Mycobacteria are important microorganisms causing infectious diseases such as tuberculosis, leprosy and mycobacteriosis. The characteristics of these bacteria make the microbiological identification slow and costly. Mass spectrometry with matrix-assisted by laser desorption / ionization time of flight (MALDI-TOF) enables the detection of proteins, which has been proved to be very useful for the identification of conventional bacteria. However, mycobacteria need pretreatment for the extraction of proteins, due to the high lipidic content of the cell wall. Objectives: a) To analyze the possibility of using MALDI-TOF for identification of species of the genus Mycobacterium, and b) to analyze and optimize different protein extraction protocols necessary for the identification of mycobacteria. Methodology: Retrospective study (March-June 2014) in the laboratory of mycobacteria in the Microbiology Department of the Hospital University of Bellvitge (Hospitalet de Llobregat). Sixty-six strains of clinical isolates were analyzed. The strains were identified by reference methods: a) phenotype; b) immunochromatographic; c) molecular (PCR-reverse hybridization and sequencing). The proteomic study of strains was performed by MALDI-TOF Microflex LT (Brucker Daltonics ®). The protocols analyzed protein extraction were three: the one set by the manufacturer (A: acetonitrile and formic acid) and two additional protocols proposed in the project (B: adding freeze and C: adding freezing using centrifugation and the supernatant). All assays were performed in triplicate. The software gives a value (score) from 0 to 3 depending on the coincidence of the results obtained from this library. A score ≥ 2 is considered species identification, a score from 1.7 to 1.999 is considered gender identification, and score from 0 to 1.699 denotes an unreliable identification. Results: Overall (A, B and C) protein detection was positive in 86% of the strains and 76% of the MALDI-TOF results correlated with the reference methods including score <1.7. The protocol B showed better results: 23% with a score ≥ 2 and 54% with a score ≥ 1.7. When combining A + B + C the results were the following: 36% with a score ≥ 2 and 56% with a score ≥ 1.7. Protocol A was the less effective: 9% with a score ≥ 2 and 11% with a score ≥ 1.7. Conclusions: Although the MALDI-TOF has proven to be a rapid, simple and economical method for the identification of mycobacterial species, it is still necessary to optimize the protein extraction method to improve its sensitivity.Introducció: Les micobactèries són microorganismes responsables d'importants malalties infeccioses com la tuberculosi, la lepra i les micobacteriosis. Algunes de les característiques pròpies d'aquests bacteris fan que la seva identificació microbiològica sigui lenta i costosa. L'espectrometria de masses amb matriu assistida per làser desorció/ionització en temps de vol (MALDI-TOF) serveix per detectar proteïnes i ha demostrat ser molt eficaç per a la identificació de bactèries convencionals. No obstant, les micobactèries necessiten un tractament específic prèvia extracció de proteïnes degut a l'elevada concentració lipídica de la seva paret. Objectius: a) Analitzar la possibilitat d'utilitzar MALDI-TOF per a la identificació de les espècies del gènere Mycobacterium, i b) analitzar i optimitzar diversos protocols d'extracció de proteïnes necessari per a la identificació de micobactèries. Materials i mètodes: Estudi retrospectiu (març-juny de 2014) al laboratori de micobactèries del Servei de Microbiologia de l'Hospital Universitari de Bellvitge (l'Hospitalet de Llobregat). Es varen analitzar 66 soques d'aïllaments de mostres clíniques, lesquals es van identificar mitjançant mètodes de referència: a) fenotípics; b) immunocromatogràfics i c) moleculars (PCR-hibridació reversa i seqüenciació). L'estudi proteínic de les soques es va realitzar mitjançant el MALDI-TOF Microflex LT (Brucker Daltonics®). Els protocols analitzats d'extracció de proteïnes han estat tres: l'establert pel fabricant (A: amb acetonitril i àcid fòrmic) i dos més proposats en aquest projecte (B: afegint congelació i C: afegint congelació amb centrifugació i emprant el sobrenedant). Tots els assajos es van realitzar per triplicat. El programa informàtic dóna un valor (score) de 0 a 3 en funció de la coincidència dels resultats obtinguts amb aquesta llibreria. Un score ≥ 2 es considera identificació d'espècie, un score 1,7-1,999 identificació de gènere i un score 0-1,699 identificació no fiable. Resultats: En conjunt (A, B i C) la detecció de proteïnes va ser positiva en el 86% de les soques i en un 76% la identificació es va correlacionar amb els mètodes de referència incloent score < 1,7. El protocol B és el que va mostrar millors resultats: 23% amb score ≥ 2 i 54% amb score ≥ 1,7. No obstant, quan es varen sumar A+B+C, les dades obtingudes foren les següents: 36% amb score ≥ 2 i 56% amb score ≥ 1,7. El protocol A va resultar ser el menys eficaç: 9% amb score ≥ 2 i 11% amb score ≥ 1,7. Conclusions: Encara que el MALDI-TOF ha demostrat ser un mètode ràpid, senzill i econòmic en la identificació de les espècies micobacterianes, encara és necessari optimitzar el mètode d'extracció de proteïnes per millorar encara més la seva sensibilitat.Introducción: Las micobacterias son microorganismos causantes de importantes enfermedades infecciosas como la tuberculosis, la lepra y las micobacteriosis. Algunas de las características propias de estas bacterias hacen que la identificación microbiológica sea lenta y costosa. La espectrometría de masas con matriz asistida por láser desorción/ionización en tiempo de vuelo (MALDI-TOF) sirve para detectar proteínas y ha demostrado ser muy eficaz para la identificación de bacterias convencionales. Las micobacterias, sin embargo, necesitan un tratamiento previo a la extracción proteica debido a la elevada concentración lipídica de su pared. Objetivos: a) Analizar la posibilidad de utilizar MALDI-TOF para la identificación de las especies del género Mycobacterium. y b) analizar y optimizar diversos protocolos de extracción de proteínas necesario para la identificación de micobacterias. Materiales y métodos: estudio retrospectivo (marzo-junio de 2014) en el laboratorio de micobacterias del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Bellvitge (Hospitalet de Llobregat). Se analizaron 66 cepas de aislamientos de muestras clínicas. La cepas fueron identificadas mediante métodos de referencia: a) fenotípicos; b) inmunocromatográficos; y c) moleculares (PCR-hibridación reversa y secuenciación). El estudio proteínico de las cepas se realizó mediante el MALDI-TOF Microflex LT (Brucker Daltonics®). Los protocolos analizados de extracción de proteínas fueron tres: el establecido por el fabricante (A: con acetonitrilo y ácido fórmico) y dos más propuestos en este proyecto (B: añadiendo congelación y C: añadiendo congelación con centrifugación y empleando el sobrenadante). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. El programa informático da un valor (score) de 0 a 3 en función de la coincidencia de los resultados obtenidos con dicha librería. Un score ≥ 2 se considera identificación de especie, un score 1,7-1,999 identificación de género y un score 0-1,699 identificación no fiable. Resultados: En conjunto (A, B y C) la detección de proteínas fue positiva en el 86% de las cepas y en un 76% la identificación se correlacionó con los métodos de referencia incluyendo score < 1,7. El protocolo B es el que mostró mejores resultados: 23% con score ≥ 2 y 54% con score ≥ 1,7. Pero cuando se sumaron A+B+C se obtuvieron los siguientes datos: 36% con score ≥ 2 y 56% con score ≥ 1,7. El protocolo A fue el menos eficaz: 9% con score ≥ 2 y 11% con score ≥ 1,7. Conclusiones: Aunque el MALDI-TOF ha demostrado ser un método rápido, sencillo y económico en la identificación de las especies micobacterianas, aún es necesario optimizar el método de extracción de proteínas para mejorar más su sensibilidad