Metode Analisis Isoflavon pada Kedelai (Glycine Max (Linn.) Merrill) Tahan Naungan Dena 1 Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kebutuhan kedelai nasional dari tahun ke tahun mengalami peningkatan tetapi produksi kedelai mengalami penurunan karena berkurangnya luas panen kedelai. Sehingga untuk menutup kekurangan produksi, Indonesia mengimpor kedelai rata-rata 70% per tahun. Peningkatan produksi kedelai nasional baik dari kuantitas maupun kualitas terus diupayakan oleh pemerintah melalui pemanfaatan areal di bawah naungan. Balitkabi telah mengembangkan varietas unggul baru kedelai tahan naungan (hingga 50%) yaitu Dena 1 dan Dena 2. Pengembangan varietas kedelai tetap harus memperhatikan kualitas kedelai yang ditandai dengan kandungan nutriennya. Kedelai (Glycine max (Linn.) Merril) adalah salah satu tanaman dari golongan Leguminosae yang merupakan sumber utama isoflavon. Konsentrasi isoflavon kedelai bervariasi tergantung pada kondisi lingkungan dalam pertumbuhan tanaman. Isoflavon sebagai salah satu nutrien memiliki banyak manfaat untuk kesehatan yaitu sebagai antioksidan dan antikanker. Isoflavon merupakan senyawa fenolik polar yang terdiri dari 4 kerangka struktur dasar yaitu aglikon, glikosida, asetilglikosida, dan malonilglikosida. Isoflavon aglikon lebih cepat dan lebih banyak diserap tubuh dibandingkan isoflavon glikosida. Pada penelitian ini varietas kedelai yang diteliti adalah kedelai tahan naungan Dena 1 karena memiliki potensi rata-rata hasil lebih besar yaitu ± 1,69 ton/ha dan belum ada informasi mengenai konsentrasi isoflavon terutama aglikon dalam kedelai Dena 1, sehingga diperlukan suatu metode analisis yang valid. Tujuan penelitian ini adalah optimasi metode KCKT untuk menganalisis isoflavon dalam kedelai tahan naungan Dena 1. Optimasi metode KCKT fase diam C18 dilakukan pada kondisi: (1) panjang gelombang detektor UV 249; 250; 254; 260; dan 262 nm, sehingga dapat diperoleh respon maksimum dan sensitivitas pengukuran yang baik; (2) laju alir 0,5; 0,8; 1,0; 1,2 dan 1,5 mL/min, semakin cepat laju alir yang digunakan maka waktu retensi yang diperlukan analit juga semakin cepat; (3) komposisi fase gerak asetonitril : 0,1% asam asam asetat teknik elusi isokratik, semakin banyak komposisi 0,1% asam asetat maka pemisahan semakin baik karena isoflavon merupakan senyawa fenolik yang bersifat asam maka kesetimbangan ionisasi bergeser ke bentuk molekul asamnya yang bersifat non polar yang dapat meningkatkan interaksi dengan kolom C18 yang non polar; (4) komposisi fase gerak asetonitril : 0,1% asam asetat teknik elusi gradien dengan kenaikan asetonitril 15-30%, sehingga pemisahan isoflavon dapat meningkat mengingat terdapat banyak isoflavon yang mungkin terdapat dalam kedelai Dena 1 serta untuk mempercepat waktu retensi analit dibandingkan dengan teknik elusi isokratik. Kondisi optimum ditentukan berdasarkan intensitas optimum dan jumlah puncak pada kromatogram dan berdasarkan nilai resolusi (Rs), jumlah plat teori (N), faktor kapasitas (k’), dan selektivitas (α) pada kromatogram optimasi laju alir sampel kedelai tahan naungan Dena 1. Kemudian dengan kondisi optimum tersebut dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi puncak standar genistein dengan puncak analit dalam sampel kedelai Dena 1 dan metode spiking. Analisis kuantitatif genistein dalam ekstrak kedelai Dena 1 menggunakan metode standar eksternal dan spiking. Hasil optimasi metode KCKT untuk analisis isoflavon genistein adalah: (1) panjang gelombang deteksi UV 260 nm; (2) optimasi laju alir menunjukkan nilai parameter kromatografi yang bagus pada semua laju alir tetapi dipilih salah satu yang menunjukkan pemisahan optimum dan waktu retensi yang sesuai yaitu laju alir 1 mL/min; (3) teknik elusi gradien dengan komposisi fase gerak (A: asetonitril; B: 0,1% asam asetat) sebagai berikut: A 15%, B 85% pada menit ke 0–3; A 20%, B 80% pada menit ke 3–12; A 25%, B 75% pada menit ke 12–17; A 30%, B 70% pada menit ke 17–23; A 25%, B 75% pada menit ke 23–30; dan A 20%, B 80% pada menit ke 30–40. Berdasarkan kromatogram sampel kedelai Dena 1 dan sampel yang dispike dengan standar genistein pada analisis kualitatif menunjukkan bahwa terdapat xii puncak yang mengalami kenaikan area pada waktu retensi 24,803 menit. Kenaikan area puncak menunjukkan bahwa isoflavon genistein terdapat dalam ekstrak kedelai Dena 1. Analisis kunatitatif menunjukkan konsentrasi genistein yang diperoleh dari metode standar eksternal adalah 0,138 ± 0,003 mg/g dan dari metode spiking adalah 0,114 ± 0,016 mg/g. Dalam kedelai Dena 1 terdapat isoflavon genistein dan senyawa isoflavon lain yang ditunjukkan beberapa puncak selain genistein tetapi belum diidentifikasi, sehingga diperlukan analisis isoflavon dalam kedelai Dena 1 menggunakan standar isoflavon selain genistein