Paparan Glukosa Tinggi Menurunkan Aktivitas Neuron Dopaminergik dan Meningkatkan Apoptosis Sel Otak melalui Jalur Sinyal Estrogen pada Embrio Zebrafish (Danio rerio)

Wanita hamil dengan diabetes mellitus memiliki resiko lebih tinggi untuk terjadinya aborsi spontan pada trimester pertama kehamilan serta terjadinya malformasi fetus mayor akibat paparan kondisi hiperglikemia. Salah satu kelainan yang diketahui ditimbulkan oleh hiperglikemia berkepanjangan selama masa perkembangan adalah malformasi pada otak janin. Hipotesis yang berkembang saat ini mengenai etiologi dari malformasi pada diabetes melitus adalah kelainan apoptosis yang diinduksi oleh hiperglikemia. Oleh karena itu muncul dugaan bahwa peningkatan apoptosis pada otak akibat hiperglikemia bertanggungjawab atas terjadinya malformasi otak pada masa perkembangan. Penelitian ini memfokuskan pada keterlibatan sinyal estrogen dalam mekanisme apoptosis pada otak yang diinduksi oleh kondisi hiperglikemia menggunakan embrio zebrafish (Danio rerio) sebagai hewan coba. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa paparan glukosa tinggi dapat menyebabkan penurunan ekspresi reseptor estrogen dan brain-formed estrogen, sehingga terjadi aktivasi jalur apoptosis secara langsung, maupun melalui down-regulation dari ekspresi glucose transporter-1 (GLUT1). Perubahan dari sinyal estrogen pada otak berdampak pada down-regulation aktivitas dopaminergik berupa penurunan ekspresi Tyrosine hydroxylase serta motilitas dari embrio. Embrio zebrafish dipapar glukosa 1 %, 3 %, dan 5 % mulai 24 hpf (hours post-fertilization) sampai akhir penelitian. RT-PCR, Whole-mount Immunofluorescence, dan Acridine orange staining dilakukan untuk mengetahui efek paparan glukosa pada ekspresi mRNA dari beberapa gen terkait glucoregulation dan sinyal estrogen, ekspresi Tyrosine hydroxylase (TH), dan apoptosis sel otak. Studi ini menunjukkan bahwa paparan glukosa tinggi meningkatkan ekspresi insulin, reseptor insulin, dan GLUT1 pada 48 jam setelah fertilisasi (hpf) kemudian tidak berubah atau menurun pada 96 hpf. Hal ini menunjukkan bahwa hiperglikemia terjadi pada embrio 96 hpf akibat kondisi hipoinsulinemia. Sehingga dapat disimpulkan bahwa hiperglikemia terjadi oleh karena peningkatan paparan glukosa gagal diikuti oleh peningkatan ekspresi insulin dan reseptornya. Modulasi sinyal estrogen di otak setelah paparan glukosa ditunjukkan oleh perubahan ekspresi mRNA reseptor estrogen (ER) dan brain-aromatase (aromB) serta didukung oleh penurunan fungsinya dalam mengatur aktivitas dopaminergik. Paparan glukosa tinggi menyebabkan peningkatan ekspresi aromB, ER–α, ER–β1, dan ER–β2 pada 48 hpf dan sebaliknya menurunkan secara dose-dependent manner pada 96 hpf. Hal ini mengindikasikan bahwa pengaruh paparan glukosa terhadap ekspresi estrogen signaling related gene tergantung pada konsentrasi dan lamanya paparan glukosa. Terbukti bahwa kondisi hiperglikemia-hipoinsulinemia pada 96 hpf memiliki potensi menurunkan ekspresi ER dan aromB. Sedangkan penurunan aktivitas dopaminergik ditunjukkan oleh penurunan yang signifikan dari ekspresi TH pada diencephalon serta respon terhadap rangsangan taktil. Pewarnaan Acridine orange menunjukkan peningkatan apoptosis sel otak yang signifikan pada embrio 96 hpf yang terpapar glukosa 3 % dan 5 %. Hal ini mengkonfirmasi hasil beberapa penelitian sebelumnya bahwa kondisi hiperglikemia dapat mengaktivasi jalur apoptosis. Selain itu, penelitian ini membuktikan suatu hipotesis bahwa penurunan sinyal estrogen akibat paparan glukosa dapat menstimulasi peningkatan apoptosis karena terganggunya fungsi estrogen sebagai anti-apoptosis. Untuk mengkonfirmasi bahwa peningkatan apoptosis sel otak berkaitan langsung dengan down-regulation aromB dan ER, dilakukan ko-inkubasi dengan E2. Peningkatan apoptosis dapat dicegah oleh koinkubasi estrogen (E2) 0,1 dan 1 μM membuktikan bahwa modulasi sinyal estrogen berperan dalam proses apoptosis yang diinduksi oleh kondisi hiperglikemia. Selain itu, koinkubasi E2 ini diketahui juga dapat mencegah penurunan ekspresi mRNA glucose transporter-1 (GLUT1) akibat paparan glukosa 5%. Pengaruh E2 dapat dicegah dengan penambahan inhibitor reseptor estrogen, 10 μM ICI, menunjukkan efek E2 diperantarai oleh ER. Down-regulation sinyal estrogen yang juga melibatkan penurunan ekspresi GLUT1 setelah paparan glukosa yang tinggi terbukti menginduksi apoptosis sel otak sehingga menyebabkan penurunan ukuran kepala embrio sebagai indikator hambatan perkembangan otak embrio. Secara keseluruhan, penelitian ini mengidentifikasi mekanisme terjadinya apoptosis pada otak yang diinduksi oleh kondisi hiperglikemia melalui paparan glukosa selama awal perkembangan zebrafish. Pertama, ditunjukkan bahwa desain penelitian ini menghasilkan embrio dengan hipoinsulinemia-hiperglikemia pada 96 hpf dan menyebabkan ukuran kepala embrio lebih kecil akibat terjadinya peningkatan apoptosis pada otak. Peningkatan apoptosis ini terjadi melalui down-regulation sinyal estrogen yang ditandai dengan penurunan ekspresi ER dan brain aromatase sehingga terjadi aktivasi jalur apoptosis. Salah satu jalur apoptosis akibat penurunan sinyal estrogen ini adalah melalui down-regulation ekspresi GLUT1. Selain itu, modulasi sinyal estrogen ini berpotensi menyebabkan down-regulation ekspresi TH pada 48 hpf dan menurunkan aktivitas lokomotor pada 72 hpf. Hal ini menandakan bahwa paparan glukosa menurunkan aktivitas dopaminergik pada otak embrio yang sedang berkembang