Optimasi Enzim Retriksi (Ecori, Hindiii, Tasi) Dalam Metode Caps (Cleaved Amplified Polymorphics Sequence) Dengan Menggunakan Marka Mtssr Untuk Identifikasi Genetik Populasi Jeruk F1 Hasil Fusi Proto

Jeruk ialah tanaman buah komersial terpenting di dunia, dan dapat tumbuh pada wilayah subtropik maupun tropis. Buah jeruk menjadi peringkat pertama dalam pasar buah internasional (Food and Agriculture Organization of the United Nations Annual Statistics, 2003 dalam Chen et al., 2007). Indonesia termasuk Negara pengimpor jerukter besarkedua di ASEAN setelah Malaysia, dengan volume imporkhususnya jeruk manis sebesar 127.041 ton selama kurun waktu 2005 – 2009 dengan rata-rata per tahun mencapai 25.408 ton. Sedangkan untuk jenis keprok atau mandarin, selama kurun waktu 2005 – 2009 mencapai 504.063 ton atau sekitar 100.813 ton per tahun (BPS, 2010). Peningkatan impor buah jeruk merupakan suatu indikator belum mampunya jeruk local bersaing dengan jeruk impor baik dalam kualitas mapupun kuantitas. Salah satu jenis jeruk local komersial yang memiliki potensi tinggi adalah jeruk Siam Madu. Jeruk siam ini memiliki karakter kulit buah tipis, berwarna kuning, rasa manis, kandungan jus tinggi dan mampu beradaptasi pada dataran rendah dan tinggi. Namun untuk menjadikan jeruk Siam Madu sebagai jeruk yang mampu bersaing dengan jeruk impor diperlukan perbaikan terhadap kualitasnya terutama pada karakter jumlah biji. Jeruk Siam Madu memiliki jumlah biji yang cukup tinggi yaitu antara 10-15 biji per buah. Perbaikan kualitas biji jeruk Siam Madu dapat dilakukan dengan memindahkan sifat tanpa biji (seedless) dari jeruk lain. Salah satu jenis jeruk yang memiliki sifat seedless adalah Mandarin Satsuma. Jeruk Mandarin Satsuma memiliki karakter kuat yaitu tanpa biji yang disebabkan polennya yang steril (Male Steril – MS) dan diketahui dikendalikan oleh gen yang berada pada sitoplasmanya (Citoplasmic Male Sterility – CMS). Berdasarkan fakta tersebut, pemindahan sifat seedless dari Mandarin Satsuma tidak dapat dilakukan melalui persilangan biasa, tetapi dapat dilakukan melalui teknologi fusi protoplasma (hibridisasi somatik). Identifikasi dan karakterisasi merupakan bagian dari seleksi dan sangat penting dilakukan setelah tanaman hasil pemuliaan diperoleh. Pada tanaman hasil fusi protoplasma (fusan), seleksi awal sangat diperlukan untuk mengetahui keberhasilan fusi protoplasma yang dilakukan. Secara genetik, tanaman fusan memiliki perbedaan dengan tanaman hasil persilangan seksual karena memiliki berbagai kemungkinan diantaranya ialah adanya perpindahan / transfer, pencampuran / mixing, dan penggabungan ulang/recombination genom dan sitoplasma (Olivares-Fuster, 2007). Interaksi genom inti DNA inti - sitoplasma (DNA mitokondria dan kloroplas) dua tetua dan senyawa yang dihasilkan dari interaksi tersebut dapat memberikan efek yang nyata pada pertumbuhan, perkembangan dan performa tanaman fusan. Telah diketahui bahwa genom sitoplasma mengontrol beberapa cirri agronomis tanaman seperti tinggi tanaman, diameter batang, besar daun dan jumlah biji. Banyak studi tentang interaksi genom inti – sitoplasma tergantung kepada informasi rinci komposisi persilangan somatik (fusi protoplasma) melalui marka pengamatan morfologi, sitologi, dan genetik. Namun untuk mengerti interaksi antara inti - inti, inti - sitoplasma, dan sitoplasma – sitoplasma antara kedua fusi parental, penggunaan marka genetika atau molekuler lebih tepat. Marka molekuler ialah alat yang efektif karena deteksinya berdasarkan variasi genetik, yang tidak dipengaruhi lingkungan (Pabendon et al., 2005). Penanda molekuler merupakan teknik yang efektif dalam analisis genetic dan telah diaplikasikan secara luas dalam program pemuliaan tanaman. Penanda biokimia seperti isozim dan storage protein merupakan produk ekspresi gen yang telah diaplikasikan untuk identifikasi bibit hasil perkecambahan biji dan studi hubungan kekerabatan antar gene dan antar spesies pada tanaman jeruk. Walaupun demikian, penggunaan penanda biokimia mempunyai keterbatasan, yaitu umur tanaman berpengaruh terhadap pola pita yang dihasilkan. Disamping itu, penanda biokimia menghasilkan polimorfisme yang terbatas, sehingga sulit untuk membedakan kultivar yang berkerabat dekat (Karsinah et al., 2002; Pabendon, 2004). Analisis molekuler dapat juga menjadi kondusif untuk korelasi fenotipik atau cirri spesifik dengan komposisi nuclear dan sitoplasmik dari hibrid yang baru (Guo et al., 2008). Untuk analisis molekuler tersebut, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dan RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) telah digunakan secara luas (Moreira et al., 2000; Guoet al., 2002), tetapi sejak perkembangan penanda molekuler yang lebih efisien dan sederhana seperti SSR (Simple Sequence Repeat), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) dan kloroplas SSR (cpSSR), identifikasi hasil fusi dapat dilakukan dengan lebih mudah dan cepat. Marka CAPS telah banyak dimanfaatkan dalam proses verifikasi dan identifikasi tanaman fusan jeruk (Guo et al., 2008). Marka CAPS merupakan marka dalam metode gabungan antara RFLP dengan PCR. Metode ini dilaporkan telah berhasil digunakan untuk analisa DNA mitokondria (mtDNA) tanaman fusan jeruk oleh beberapa peneliti (Guo et al., 2008). Cai et al. (2009) lebih jauh melaporkan metode CAPS dengan primer universal untuk identifikasi mtDNA berhasil menunjukan adanya perbedaan band antara tetua dan tanaman fusannya. Tujuan kegiatan penelitian ini ialah untuk memperoleh informasi kombinasi dari primer dan enzim retriksi yang paling tepat dan memunculkan frekuensi polimorfisme yang tinggi pada tanaman sampel baik parentalnya maupun hasil fusi protplasmanya berdasarkan penanda molekuler mitokondria (mtSSR) dengan metode CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence). Penelitian ini akan dilaksanakan dari bulan April-Juni 2013 di Laboratorium pemuliaan Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (BALITJESTRO) Tlekung, Kecamatan Junrejo, Kota Batu.. Alat yang digunakan ialah mortar, pestel, gelas ukur, erlenmeyer, timer, beaker glass, stirrer, mikropipet, timbangan analitik, vortex, tabung eppendorf, mesin spektofotometer, autoclave, waterbath, mesin centrifuge, mesin elektroforesis, mesin PCR dan alat biodoc analyze. Bahan yang digunakan ialah daun muda dari 50 tanaman jeruk fusan dan kedua parentalnya (Siam Madu dan Mandarin Satsuma), aquadest, alcohol 70%, mercaptoethanol, pvp (polyvinyl pyrrolidone 10), buffer ekstrasi, ammonium asetat, CTAB (CetylTrimethyl Ammonium Bromide), Chlroform:Isoamylalcohol (24:1) (CHISAM), ethanol dingin, isopropanol dingin, buffer TE, buffer pencuci, RNAse (Roche), ethanol 96 % dingin, Agarose SPI (Duchefa Biochemie), Agarose Molecular Screening (Roche), buffer TBE, PCR mix (Fast Start PCR Master, Roche), Aqua bidestilata steril (Ikapharmindo), DNA ladder 100 bp (Promega), Ethidium Bromide (EtBr), loading dye (Fermentasi; Promega) dan menggunakan 2 pasang primer mtSSR (forwarddanreverse) yaitu primer 18S rRNA-5S rRNA dan nad1 exonB-nad 1 exon C (Latharet al., 2010). Metode Kerja Hasil penelitian menunjukkan kombinasi antara enzim retriksi ecoRI dengan primer 18S_rRNA_F/R maupun dikombinasikan dengan primer nad 1 exon C/B terbukti tidak dapat memunculkan adanya kehadiran pola fragmen pada DNA sampel pada semua tingkat waktu perlakuan. Kombinasi antara enzim retriksi hindIII dengan primer 18S_rRNA_F/R terbukti tidak dapat memunculkan adanya kehadiran pola fragmen pada DNA sampel pada semua tingkat waktu perlakuan, sedangkan ketika dikombinasikan dengan primer nad 1 exon C/B terdapat kehadiran pola fragmen pada DNA sampel pada tingkat waktu perlakuan T1(3jam), T2(6jam) dan T3(9jam), sedangkan kombinasi paling baik ialah kombinasi antara enzim retriksi tasI dengan primer 18S_rRNA_F/R dan primer nad 1 exon C/B, hal ini dikarenakan konsistensinya memunculkan kehadiran pola fragmen DNA sampel dengan baik pada kedua pasangan primers pada perlak