Determination of functional RNA binding sites for MBNL proteins using antisense oligonucleotides

Wydział BiologiiRodzinę białek Muscleblind-like tworzą trzy paralogi (MBNL1, 2 i 3) będące regulatorami alternatywnego splicingu kluczowymi podczas rozwoju wielu tkanek, głównie mięśni i komórek nerwowych. Białka MBNL mają również związek z patomechanizmem dystrofii miotonicznej (DM), choroby degeneracyjnej mięśni, w której dochodzi do sekwestracji białek MBNL na mRNA zmutowanego genu, co prowadzi do masowej deregulacji alternatywnego splicingu w komórkach pacjentów. W trzech publikacjach składających się na moją rozprawę doktorską przedstawiłem połączenie strategii AON i minigenów hybrydowych, jako wydajnej metody do weryfikacji potencjalnych miejsc wiązania dla MBNL wyłonionych na drodze głębokiego sekwencjonowania RNA. Podejście to umożliwiło też potwierdzenie hipotezy o rozpoznawaniu tych samych fragmentów RNA przez wszystkie paralogi MBNL. Konstrukty bazujące na minigenie hybrydowym zostały także wykorzystane w badaniach nad aranżacją strukturalną RNA miejsc wiązania dla białek MBNL jak i opracowaniu testu dla poszukiwania lub walidowania potencjalnych inhibitorów sekwestracji MBNL w DM. Ponadto, wykazano antagonistyczną rolę białek MBNL1 i SRSF1 w regulacji alternatywnego splicingu. Analiza dystrybucji trzech alternatywnych eksonów w transkryptach genów MBNL wykazała ich zróżnicowane włączanie do mRNA w poszczególnych tkankach na różnych etapach rozwoju oraz zaburzenie tego procesu w mięśniach pacjentów z DM. Z kolei w projekcie wykazującym wpływ organizacji miejsc wiązania w RNA na aktywność regulatorową MBNL dostarczyłem danych o poziomie ekspresji poszczególnych badanych białek MBNL.Muscleblind-like protein family gathering three paralogs (MBNL1, 2 and 3) is a group of alternative splicing regulators essential during the development of particular tissues, primarily, skeletal muscles and neuronal cells. MBNLs are also involved in the pathomechanism of myotonic dystrophy (DM), a disorder in which occurs the sequestration of MBNLs on the mRNA of a mutated gene leading to massive misregulation of alternative splicing in patients' cells. In three articles encompassed in my dissertation I presented combination of AONs and hybrid-type minigenes as an efficient method for validation of potential MBNL-binding sites extracted from high-throughput data. Using this approach I also confirmed the hypothesis that all MBNL paralogs recognize the same sequence in RNAs. Hybrid minigene-based constructs were also used in research on MBNL-binding sites spatial arrangement as well as in the development of assay for searching or validation of potential MBNL sequestration inhibitors in DM. Furthermore, I participated in experiments revealing antagonistic role of MBNL1 and SRSF1 proteins in alternative splicing regulation of exons via, either, structural rearrangements or competition for binding sites in RNA. In another project I analyzed the distribution of three alternative exons in the transcripts of MBNL genes which revealed differential inclusion among particular human tissues at different developmental stage and in DM patients' samples. In the project which focused on the impact of binding sites organization on MBNLs' activity I provided results quantifying expression level of particular MBNL proteins