Método de cuantificación de Ab40 y Ab42 en el plasma y aplicación de los índices Ab42/40 como posibles biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo progresivo que afecta mayoritariamente a individuos de edad avanzada y que representa la causa más común de demencia, un trastorno que afecta a unos 50 millones de personas en todo el mundo. Los dos rasgos histopatológicos característicos de la EA son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares. Las placas seniles son depósitos extracelulares compuestos principalmente por fibrillas insolubles de péptido beta-amiloide (Aβ), mientras que los ovillos neurofibrilares son intracelulares y se considera que están compuestos mayoritariamente por agregados de proteína tau hiperfosforilada. En la actualidad se considera que existe una larga fase preclínica de la enfermedad en la que se van produciendo alteraciones fisiopatológicas sin que todavía hayan aparecido los primeros síntomas clínicos. Esta fase preclínica representa un periodo de tiempo muy importante para la aplicación de terapias modificadoras del curso de la enfermedad, las cuales presumiblemente tendrán una mayor eficacia que la observada hasta el momento, ya que, hasta ahora, se han aplicado en las fases más avanzadas de la enfermedad. No obstante, es obvio que el diagnóstico de la EA en esta fase pre-sintomática no puede llevarse a cabo en base a los síntomas, que todavía no se han manifestado, sino que es necesario el uso de biomarcadores de la enfermedad. Durante los últimos años se ha realizado un gran esfuerzo a nivel internacional para identificar biomarcadores de la EA que ayuden tanto en el diagnóstico diferencial, como en la identificación de individuos de alto riesgo. En la actualidad ya se están utilizando algunos biomarcadores de líquido cefalorraquídeo y otros de neuroimagen, tanto en el ámbito de la investigación como, de forma incipiente, en el diagnóstico clínico. Sin embargo, a pesar de que algunos de estos biomarcadores presentan un buen rendimiento diagnóstico y pronóstico, su uso en la práctica clínica diaria o como herramienta de cribado poblacional se ve limitado por tratarse de procedimientos invasivos o de elevado coste. Por todo ello, la identificación de biomarcadores de la EA en tejidos periféricos de fácil acceso, como puede ser la sangre, que además sean capaces de reflejar los procesos patológicos que están sucediendo en el sistema nervioso central (SNC), supondría un avance enorme.De acuerdo con la hipótesis de la cascada amiloide, la acumulación y agregación de Aβ es el primer evento fisiopatológico que desencadena una serie de acontecimientos posteriores que conducen a la enfermedad. Además, se conoce que existe un transporte activo de Aβ entre el SNC y la sangre. En conjunto, estos datos sugieren la posibilidad de que los niveles plasmáticos de Aβ puedan utilizarse como biomarcadores de la EA. Persiguiendo la confirmación de esta hipótesis, en Araclon Biotech hemos desarrollado dos inmunoensayos de tipo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sándwich, denominados ABtest40 y ABtest42, con los que llevamos a cabo la cuantificación de los péptidos Aβ40 y Aβ42. La sustitución del anticuerpo comercial de captura utilizado con anterioridad por un anticuerpo monoclonal de producción interna en nuestro laboratorio, ha motivado el desarrollo de un nuevo proyecto de validación. Con ello hemos demostrado que nuestros kits ABtest40 y ABtest42 son dos herramientas sensibles, específicas y precisas para la cuantificación de los péptidos amiloides Aβ40 y Aβ42 en plasma. Mientras que la determinación de los niveles de Aβ en el plasma sin diluir nos aporta información acerca de la concentración del péptido que se encuentra libre en la sangre, la determinación de los niveles de Aβ en el plasma diluido en un tampón expresamente formulado por nosotros nos informa acerca de los niveles plasmáticos totales de Aβ. Sin embargo, la cuantificación de los péptidos Aβ en el plasma no es un procedimiento sencillo. Sus propiedades fisicoquímicas, sus capacidades para interaccionar con otras proteínas del plasma y la baja concentración a la que se encuentran, dificultan su reconocimiento y cuantificación fiable. Además, existe una amplia lista de variables analíticas y pre-analíticas que pueden tener un impacto importante sobre los niveles de Aβ publicados por laboratorios que utilizan diferentes metodologías y procedimientos. En concreto, en este trabajo hemos observado que tanto el protocolo de procesado de las muestras de sangre como el tipo de anticoagulante utilizado tienen un efecto sobre los niveles de Aβ cuantificados en el plasma. Además, hemos constatado que el tratamiento de las muestras de sangre con un cocktail de inhibidores de proteasas exógenos no se traduce en la detección de niveles plasmáticos más elevados de Aβ. Asimismo, también hemos comprobado que los niveles de Aβ cuantificados en el plasma no varían sustancialmente cuando el procesado de las muestras se pospone hasta 30 horas, siempre y cuando se conserven en refrigeración (2-8 °C). Estos resultados han permitido establecer un protocolo más eficiente para la obtención y análisis de las muestras, facilitando la aplicación de ABtest en el marco de la investigación clínica de la EA.Finalmente, en este trabajo hemos evaluado el potencial del índice plasmático Aβ42/Aβ40 (Aβ42/40) como posible marcador de la deposición cortical de Aβ en una cohorte de individuos sanos pertenecientes al estudio AIBL (Australian Imaging, Biomarker & Lifestyle Study of Ageing), a los que se les ha realizado un seguimiento de 72 meses. Para ello se ha tomado como estándar de referencia un test de neuroimagen ampliamente utilizado, el PET-amiloide (PET-Aβ), con el que se evalúa el grado de deposición fibrilar de los péptidos amiloides en el SNC. Los resultados de los estudios transversal y longitudinal que hemos realizado muestran que las ratios o proporciones plasmáticas Aβ42/Aβ40 (simplificado como Aβ42/40) más bajas se asocian con una mayor deposición de amiloide a nivel cortical. Además, en la población estudiada el modelo que incluye el índice plasmático Aβ42/40 ha mostrado un valor predictivo positivo (VPP) del 81 % para detectar la patología amiloide cortical. Este dato representa un incremento del 110 % sobre la prevalencia de individuos con carga amiloide cortical positiva en la población de controles sanos. En conjunto, los resultados de este estudio sugieren que el biomarcador plasmático Aβ42/40 podría utilizarse como una primera herramienta, económica y poco invasiva, en un proceso de diagnóstico secuencial para la identificación de individuos sanos con carga amiloide cortical elevada, de cara tanto a su participación en ensayos clínicos, como para, cuando estén disponibles, poder aplicar potenciales terapias modificadoras del curso de la enfermedad.