Identificación de residuos implicados en la formación del sitio activo de la OMEGA-3 desaturasa reticular FAD3 de Arabidopsis thaliana.

Las desaturasas de ácidos grasos son enzimas que introducen un doble enlace en la cadena alquílica de un ácido graso. Estas proteínas tienen un gran interés biotecnológico por la posibilidad de modificar la resistencia de las plantas al frío o de manipular estos enzimas para producir aceites vegetales enriquecidos en ácidos grasos ω3, de interés para la industria química o alimentaria, entre otras. Las desaturasas son proteínas transmembrana con carácter hidrofóbico, lo que dificulta su purificación y posterior cristalización, por lo que su estructura tridimensional, así como los aminoácidos que conforman su centro activo es desconocida. En un trabajo previo, se caracterizaron dos mutantes del gen AtFAD3, que codifica la ω3 desaturasa FAD3, con deficiencias en el contenido de ácidos grasos trienoicos y, más concretamente, 18:3. El genotipado de estos mutantes reveló la existencia de dos mutaciones puntuales en el gen AtFAD3 que serían las responsables de la pérdida de actividad FAD3. Partiendo de esta información previa, en este trabajo se planteó un estudio estructura-función de la ω3 desaturasa reticular FAD3 de Arabidopsis thaliana. Para ello se llevó a cabo un estudio del modelo de plegamiento de la proteína FAD3 de Arabidopsis, utilizando un servidor de modelado, PHYRE2. Este estudio mostró que la C103, es un residuo situado en el sitio activo de la enzima y cuya modificación produce una pérdida total de la actividad de la misma. Por el contrario, el residuo G292 estaría situado en una zona fuera del sitio activo, lo que explicaría que su sustitución no tenga un efecto tan drástico sobre la actividad de la enzima. Se intentó, en una segunda parte del trabajo, determinar los parámetros enzimáticos de la enzima mediante ensayos piloto de expresión de FAD3 en un sistema heterólogo como Sacharomyces cerevisiae. A pesar de que se consiguió expresar las distintas formas del gen AtFAD3 en levaduras, no se consiguieron obtener resultados que indicasen la existencia de actividad ω3 desaturasa en las levaduras. Los resultados apuntan a un problema derivado de la oxidación del 18:2, sustrato de FAD3, como causa de los problemas observados