Valoración del antígeno del core como alternativa en el cribado rutinario y de urgencia del virus de la hepatitis C

El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de la familia Flaviviridae cuya transmisión es principalmente por vía parenteral. Es un virus que desarrolla su fase aguda de modo asintomático para el hospedador pero que, superada dicha fase aguda, tiene una tendencia de más del 80% a la cronificación. La cronificación de la hepatitis C desemboca en un elevado número de los casos en cirrosis y en hepatocarcinoma (de hecho el VHC se considera una causa importante de trasplante hepático en España derivado de la elevada tasa de hepatocarcinomas o cirrosis hepática que produce en su fase crónica). La prevalencia de la infección crónica por VHC es elevada en África y Asía (>3%), y en menor proporción en países industrializados de Occidente (En España, la prevalencia actual de la infección parece ser mayor que la descrita en la bibliografía del momento. Según un estudio de Arroyo Fernández y cols. la infección está presente en el 10% de las muertes naturales en nuestro país, alcanzando casi un 40% en los penitenciarios españoles, y el 60% de las muertes relacionadas con el consumo de drogas. El 27% de las cirrosis y hasta el 65 % de los casos de carcinoma hepatocelular (CHC) suceden en pacientes infectados por el VHC.La transmisión de la infección puede suceder de diferentes formas, y podemos dividirla en parenteral (actualmente los factores de riesgo más significativos para la transmisión, por su evidente falta de control, son la adicción a drogas por vía parenteral (ADVP) y la práctica de tatuajes y piercings) y en no parenteral (comprende principalmente vías de contagio de bajo riesgo como la transmisión perinatal y la transmisión sexual).Es por ello que se trata de una enfermedad de primer orden en la sanidad y que, como tal, debe de tenerse en cuenta a la hora de aplicar protocolos profilácticos para minimizar su incidencia sobre la población. 1.-Aspectos clínicos de la hepatitisC¿ Infección agudaComo regla general la primoinfección es asintomática en el 90-95% de los casos. Las formas agudas suelen ser poco habituales (10%) y poco llamativas. El periodo de incubación se estima entre 2 y 26 semanas aunque en el 80-90% de los infectados los síntomas aparecen entre las 4 y 10 semanas; la incubación de las postransfusionales es más corto. El cuadro clínico de la forma aguda es similar al de otras hepatitis, pero el virus C no suele producir ictericia y el nivel de ALT suele ser igualmente más bajo y generalmente fluctuante, alcanzando su máximo nivel entre los 30 - 60 días postinfección y en coincidencia con la inflamación aguda del hígado. Cuadros más intensos no suelen ser habituales (5%) y dependen en gran parte de la dosis infectiva. Las formas fulminantes son muy poco frecuentes.¿ Infección crónicaAunque la resolución definitiva de la enfermedad es posible (10 - 25 % de los casos), lo más frecuente en cualquiera de sus formas clínicas es la evolución a la cronicidad. La proporción de pacientes con infección aguda por virus C que se transforman en infecciones crónicas se estima que es un 60-70%. Si la infección ha sido adquirida por transfusión, la cronicidad es la norma en el 50-70% de los infectados mientras que en los casos esporádicos estas cifras descienden a rangos del 15- 30%. Sólo el 40-60% de los pacientes con infección crónica desarrollan hepatitis, la situación puede variar desde un estado asintomático sin daño hepático hasta una forma con hepatitis rápida que en poco tiempo, 8 o 10 años, produce cirrosis. Lo habitual es que esta evolución se haga en un periodo de 20 o 30 años. La práctica repetida de biopsias hepáticas muestra una gran heterogeneidad entre los pacientes infectados crónicamente por VHC. En algunos casos las lesiones se mantienen estables durante años, en otros empeoran progresivamente y en otros alternan fases de empeoramiento y de mejoría. La progresión a cirrosis, parece producirse de forma gradual, por lo que la proporción de pacientes cirróticos aumenta con el paso de los años. No se han comprobado diferencias claras en la evolución entre los pacientes con hepatitis por VHC adquirida por transfusión y la de adquisición esporádica.Con independencia de la evolución histológica, que puede ser muy evolucionada incluso en pacientes totalmente asintomáticos y con ALT normales, las manifestaciones clínicas de la hepatitis crónica por VHC se mantienen modestas a lo largo de los años. La mayoría de los pacientes siguen libres de síntomas o con mínimas molestias inespecíficas que rara vez interfieren con su actividad cotidiana. Esta ausencia de síntomas se comprueba no sólo en los pacientes que presentan lesiones hepáticas estables y mínimas sino también en los que progresan a la cirrosis, por lo que permanecer asintomático no garantiza una evolución favorable.La gran mayoría de los pacientes con hepatocarcinoma asociado al VHC padecen cirrosis, sin embargo, aproximadamente un 3% de los hepatocarcinomas se desarrollan sobre hígados no cirróticos. A pesar de la ausencia de integración de este virus estos datos confirman la existencia de un efecto oncogénico directo del VHC. El intervalo entre la infección por VHC y la aparición del hepatocarcinoma es de 7 a 25 años. Para terminar, es posible que la aparición de mutantes que escapen a la vigilancia del sistema inmune explique en muchos casos la persistencia de la infección. Es así mismo posible que la infección, por variantes genéticas con distinta capacidad aparecidas en el curso de la infección crónica bajo la presión del sistema inmune o adquiridas en el momento del contagio, pueda contribuir a explicar la marcada variabilidad evolutiva de la infección crónica por VHC. 2.-Diagnóstico de laboratorio de la infección por VHCExisten dos métodos diagnósticos, directos (métodos moleculares o virológicos) que determinan y cuantifican el ARN viral mediante la detección de los componentes estructurales virales, y métodos diagnósticos indirectos entre los que se encuentran las técnicas serológicas que detectan el antígeno del core del VHC y aquellas que detectan anticuerpos específicos del VHC.2.1.-Diagnóstico indirectoa)Detección de anticuerpos:Del 25% al 30% de los pacientes con infección aguda desarrollan síntomas, aproximadamente el 50-70% tendrán anticuerpos detectables en el periodo inicial (4-6 semanas), pero el 90% tendrán anticuerpos detectables después de 3 meses. Los ensayos serológicos detectan una infección activa o pasada, pero no puede discriminar una infección crónica, aguda o resuelta. Los Anti-VHC IgM pueden ser detectados en un 50-93% de pacientes con VHC aguda y en un 50-70% de los casos crónicos, por lo que no son un buen marcador de infección activa. Caso aparte merecen los recién nacidos. En ellos, los anticuerpos maternos, transmitidos pasivamente, pueden mantenerse positivos (siendo sus madres infectadas por VHC) de 12 a 15 meses, y extraordinariamente hasta los 18 meses.La variedad de proteínas producidas durante el proceso de replicación del VHC produce una respuesta serológica muy variada frente a él. No ha podido encontrarse una relación precisa entre los diferentes patrones de respuesta inmune y el estadío biológico o clínico de la infección. Únicamente sabemos con certeza que los anticuerpos frente al core (antígeno c22-c) y NS3 (c33-c) son los primeros en aparecer en los cuadros de primoinfección. PRUEBAS SEROLÓGICAS DE CRIBADO DE ANTICUERPOS TIPO IgG FRENTE AL VHCLos métodos EIA son los que están en uso. Contienen una mezcla de péptidos sintéticos o recombinantes, o una combinación de ambos, frente a los que se miden los anticuerpos IgG que tiene la muestra. Cuando se indica que un suero es reactivo con esta metodología se está diciendo que tiene anticuerpos frente a alguno o todos los antígenos empleados en la prueba pero no sabemos frente a cuál o cuáles. Las pruebas serológicas han evolucionado con el tiempo mejorando su sensibilidad y especificidad. En la actualidad las diferentes marcas poseen diferentes mezclas de antígenos y son considerados de ¿3ª generación¿. Todas poseen antígenos derivados de la nucleocápside (c22-3), de la región no estructural NS3/NS4 (c33-c, c100-3. C200) y de alguna parte de NS5.Han pasado a la historia ¿los EIA de 1ª y 2ª generación¿; nadie los emplea puesto que no se fabrican. Debemos de ser precavidos al interpretar datos epidemiológicos obtenidos con pruebas antiguas que en algunos casos carecían de la suficiente sensibilidad.Un resultado positivo indica exposición al VHC. En la mayoría de los casos se correlaciona con la presencia de ARN-VHC en la sangre por lo que es un marcador de alto valor predictivo de infección viral. Esto es especialmente cierto con las reactividades elevadas de anticuerpos obtenidas con ciertas marcas de EIA. En un 20-25% de los casos, indica también exposición pasada y curada.DETECCIÓN DE ANTICUERPOS TIPO IgM FRENTE AL VHCSe ha detectado respuesta de tipo IgM contra el antígeno ¿core¿, NS3 y NS4, que habitualmente coincide en el tiempo con la respuesta de tipo IgG. La respuesta más intensa de IgM está dirigida contra el antígeno del ¿core¿ y en algunos casos es el primer marcador que aparece tras la infección por el virus. La duración de la respuesta de IgM es habitualmente breve pero es frecuente seguir detectándola en la fase crónica de la enfermedad. En cualquier caso no se ha demostrado que la determinación de IgM anti-VHC en el diagnóstico de la infección aporte datos claros y concluyentes sobre la biología o estadío de la infección viral. ¿ ENSAYOS CONFIRMATORIOS Se han desarrollado ensayos suplementarios para confirmar la especificidad del resultado del EIA. Chiron corporation fue la primera compañía en desarrollar un inmunoensayo en tira de nitrocelulosa para ayudar a diferenciar verdaderos positivos de falsos positivos obtenidos en los enzimoinmunoensayos. Posteriormente la FDA aprobó el inmunoensayo recombinante se segunda generación (RIBA), esto fue en 1993. Los inmunoensayos en tira de nitrocelulosa incluyen los antígenos EIA, y además superóxido dismutasa humana (hSOD). Los antígenos recombinantes c-33-c y NS5 que se usan en el EIA se sintetizaron fusionando el antígeno con la hSOD. La hSOD se incluye para detectar anticuerpos no específicos. El RIBA es considerado positivo si hay reacciones con al menos dos antígenos con intensidades superiores o iguales al control positivo débil y no hay, además, reacción frente a hSOD. Los RIBAs indeterminados se dan cuando hay reacción con un solo antígeno o cuando hay reacción frente la hSOD y en uno o más antígenos. El cambio de c100 a c22 como proteína recombinante, en la tercera versión del RIBA ha reducido significativamente el número de resultados indeterminados.Otro inmunoblot basado en el mismo principio es en Line Inmuno Assay (LIA) (Innogenetics®), que incorpora antígenos de la región del core, de la región hipervariable de E2, la región NS3, NS4A, NS4B y NS5. En el caso del ensayo LIA, una muestra es positiva para anticuerpos Anti-VHC si al menos dos bandas de antígeno de VHC tienen intensidad ± o superior. Los LIAs indeterminados se dan en dos situaciones: Cuando únicamente una banda de antígeno de VHC tiene una puntuación 1+ o superior o si la banda NS3 reacciona con una intensidad ± o superior y todas las demás bandas de antígeno son negativas.b) Detección del Antígeno del core del VHCHay diferentes argumentos para considerar la proteína del core diana adecuada para el diagnóstico de la hepatitis C. En primer lugar, sus anticuerpos se encuentran en la mayoría de pacientes infectados por VHC, la secuencia de aminoácidos de la proteína del core es común en todos los genotipos y, por último, la presencia de anticuerpos frente al antígeno del core está relacionada con la replicación viral. A modo comparativo con la detección del ARN viral, éste es un método más sencillo de llevar a cabo gracias a que todo su proceso está automatizado, el escaso volumen que necesita (158 µl frente a 650 µl de la PCR en tiempo real), y rápido de llevar a cabo además de otras facilidades de su procedimiento.Los primeros intentos para desarrollar una técnica para la detección del VHC se remontan al año 1992, la diana de estos ensayos era la proteína del core del VHC, que es la más abundante en el virión y cuyos epítopos se hallan bien conservados en los diferentes genotipos y además son bien conocidos.En el año 1999 se publicó el primer método para la detección del antígeno del core de VHC (VHCcAg) en suero. Este método mostró ser capaz de detectar concentraciones de hasta 0.06 pg/mL de VHCcAg recombinante, lo que equivale a una concentración de viriones de aproximadamente 500 copias/mL. También detectó infecciones por cinco genotipos diferentes (1a, 1b, 2b, 3a y 3c), las correlaciones obtenidas sobre muestras positivas por PCR VHC fueron del 94.5-96%. Así mismo el método mostró no verse afectado por la presencia de anticoagulantes en la muestra (EDTA, heparina, citrato) ni de otras sustancias que pueden interferir en este tipo de ensayos, como la hemoglobina, el factor reumatoide, la bilirrubina y los lípidos.Si se exceptúa el periodo de ventana de la infección aguda y las infecciones en pacientes inmunodeprimidos, las partículas virales de VHC circulantes coexisten en el suero del paciente infectado con concentraciones variables de anticuerpos específicos frente a sus distintas proteínas. Al disgregar los viriones para liberar los antígenos, estos vuelven rápidamente a formar inmunocomplejos con sus anticuerpos específicos. Y no es posible detectarlos si no se incluye algún componente que prevenga la formación de inmunocomplejos o algún procedimiento para destruirlos. El primer ensayo se desarrolló para uso en bancos de sangre con el objeto de detectar la infección por VHC en pacientes negativos con el ensayo que detectaba anticuerpos Anti-VHC (donantes en periodo de ventana). Este primer ensayo descrito por Tanaka, no disponía de tratamiento de disociación de inmunocomplejos, por lo que era negativo en los pacientes que poseían los dos marcadores (VHCcAg y Anti-VHC). El primer ensayo, posteriormente modificado por Aoyagy con la adicción en un paso de la disociación de inmunocomplejos, permitía la detección de antígeno, tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos Anti-VHC. El uso de una combinación adecuada de agentes detergentes durante el proceso de liberación del antígeno presente en la muestra permite inhibir la formación espontánea de inmunocomplejos en la medida necesaria para detectar los antígenos liberados de los viriones. El ensayo de cuantificación del VHCcAg posee buena especificidad (99,5%), es independiente del genotipo y ha mostrado una baja variación intra e interensayo. Su sensibilidad analítica se ha establecido como ¿ 3.00 fmol/l (3.00 fmol/l se consideran positivas y muestras 3.00-10 fmol/l se consideran resultados en zona gris que deberían repetirse). Después de la infección por el virus de la hepatitis C la detección del antígeno del core se retarda de 1 a 2 días respecto a cuando el ARN viral se hace detectable. También muestra una buena correlación con el ARN viral, por lo que algunos tutores le atribuyen un papel como marcador de la replicación viral.A partir de la incorporación del paso de disociación de inmunocomplejos se han realizado diversos estudios sobre su posible aplicación en la monitorización del tratamiento con ribavirina e interferón y sobre su utilidad para determinar la respuesta temprana al tratamiento en pacientes infectados con el genotipo 1, a la semana 12 del inicio del mismo, tanto sin coinfección por el VIH como coinfectados con el VIH.2.2.-Diagnóstico directo: diagnóstico molecularEl diagnóstico molecular en el caso del VHC se basa en la detección del ARN del virus en la muestra clínica y se puede dividir en dos tipos: métodos cualitativos (sólo detectan) y métodos cuantitativos (detectan y además cuantifican).Las pruebas cualitativas se utilizan para confirmar una infección activa por VHC en algunos pacientes seropositivos con resultados dudosos, para diagnosticar la infección en los seronegativos con alta sospecha (infección muy precoz) y en los pacientes inmunodeprimidos y recién nacidos. Las pruebas de detección cuantitativas de medición de carga vírica y la detección de los genotipos se usan para evaluar la enfermedad por VHC y para establecer un pronóstico sobre la eficacia del tratamiento y monitorizar la respuesta a éste.La detección y cuantificación generalmente se realiza en muestras de suero y plasma, siendo muy importante una estricta y correcta manipulación de las muestras para obtener una buena rentabilidad. Deberían ser separadas de los hematíes en un plazo no superior a las cuatro horas tras la extracción de la sangre, para prevenir la degradación del ARN por las ARNasas endógenas. Se recomienda su rápida refrigeración y almacenamiento a -70ºC para asegurar la óptima estabilidad del ARN. Deben evitarse las sucesivas congelaciones y descongelaciones. El proceso de manipulación preanalítica (separación de sueros y alicuotado) es proclive a producir contaminaciones cruzadas entre muestras negativas y positivas, por lo que deben extremarse las precauciones, al ser técnicas de una gran sensibilidad.Debido a que la cantidad de ARN viral en el suero del paciente es muy baja, se requiere un paso de amplificación de la diana, como la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, previa retro-transcripción (RT-PCR), o de la señal de detección, como el branched DNA (bDNA). Para la RT-PCR un paso de retro-transcripción convierte el ARN viral en ADN complementario (ADNc) que es utilizado como diana para la PCR. Los cebadores utilizados para la amplificación hibridan en la región 5¿-UTR, que es la más conservada del genoma del virus.PCR en tiempo real En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado a cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN sintetizado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de reacción de amplificación.Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación. Los sistemas de detección de fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y sondas específicamente marcadas con fluorocromos. Los agentes intercalantes son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando están unidos al ADN de doble cadena. El más utilizado es el SYBR Green I. El principal inconveniente de este tipo de detección es su baja especificidad, ya que estos fluorocromos se unen indistintamente al producto amplificado, a productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores.Las sondas de hibridación específicas son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador o un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre las dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis TaqMan.Su coeficiente de variación intra e interensayo es de 1 y 6,2% respectivamente. La sensibilidad puede detectar al menos 10 UI/mL (cuando los métodos convencionales de PCR poseen sensibilidades en torno a 600 UI/mL). Se han desarrollado sistemas comerciales automatizados. La relación entre el nivel de fluorescencia y la carga viral se calcula mediante patrones de concentraciones de ARN del VHC ya conocidas (diluciones estándar). Finalmente, conociendo el nivel de fluorescencia de cada muestra y su relación con la carga viral, se calcula la concentración de ARN de la muestra que, como en el resto de técnicas moleculares, se expresa en UI/mL mediante la incorporación del estándar de la OMS.Evolución de los marcadores durante la primoinfecciónEn estos casos los anticuerpos pueden hacerse detectables entre las semanas 4-6 después del comienzo de la enfermedad pero puede alargarse como media a las 8 semanas (depende en gran parte de la dosis infectiva que aportó el mecanismo de transmisión). También puede detectarse IgM. El título más elevado de anticuerpos suele establecerse después que lo hayan alcanzado las ALT. En esta fase los anticuerpos están dirigidos fundamentalmente contra c22, c33-c, ambos muy antigénicos, y NS5.El ARN es el primer marcador en aparecer y el antígeno del core del VHC aparecerá entre 0 y 2 días después a éste. Por lo tanto ambos son detectables mucho antes de la seroconversión y su concentración suele ir en incremento hasta que los anticuerpos alcanzan su meseta. Luego, si el paciente c