Nuevos inmunosensores magnéticos de transducción espectrofotométrica y electroquímica para la determinación de deoxinivalenol en cereales

El objetivo general de este trabajo fue el desarrollo y optimización de inmunosensores electroquímicos para la determinación cuantitativa de la micotoxina deoxinivalenol (DON), basados en esquemas de inmunoensayo directo competitivo con anticuerpos específicos como elementos de biorreconocimiento. Estos inmunosensores deben de tener la suficiente selectividad (frente a otras micotoxinas), especificidad y sensibilidad, para su aplicación en muestras de cereales [1; 2]. Para el caso concreto del deoxinivalenol (DON), micotoxina de la familia de los tricotecenos de tipo B producido a través del metabolismo secundario del hongo Fusarium graminearum, los métodos analíticos disponibles para su determinación se basan principalmente en los principios de inmunoensayo, cromatografía, y espectrometría de masas, con los que se obtienen resultados tanto cualitativos como cuantitativos [3]. El método oficial según la AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para la determinación de DON es la cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta (HPLC-UV-Vis) por tratarse de un método robusto y exacto. Por contra, el HPLC-UV-Vis necesita largos tiempos de análisis, y es un método poco económico y ecológico debido al elevado consumo de reactivos y disolventes orgánicos que se precisan [4], necesita instrumentación sofisticada y poco económica, así como una alta cualificación del personal técnico en las operaciones analíticas y en el manejo de la instrumentación [5]. Los inmunosensores para la determinación de DON no han sido muy desarrollados hasta el momento, a diferencia de los muy diversos y numerosos ensayos ELISA, pero los resultados obtenidos con el limitado número de biosensores existentes en muestras de alimentos (maíz, trigo o alimentos preparados de origen cereal) demuestran que pueden llegar a ser unas potentes y novedosas herramientas analíticas para la determinación de DON, manteniendo una alta correlación con los resultados validados obtenidos con la metodología oficial (HPLC-UV-Vis) [6]. Debido al escaso trabajo en inmunosensores electroquímicos de DON, el trabajo de esta Tesis Doctoral pretende contribuir a un mayor desarrollo de los mismos. El objetivo general expuesto se puede dividir en diferentes partes: - Se realizó un estudio de la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y dos anticuerpos, un anticuerpo policlonal y otro monoclonal (pAbDON y mAbDON respectivamente), realizando la comparación de la reacción de afinidad de los anticuerpos con conjugados DON-HRP (uno procedente de un proceso de síntesis y otro conjugado comercial) utilizando el enzima peroxidasa (HRP) como etiquetado del inmunoensayo. En este estudio se observó la baja afinidad existente entre el anticuerpo policlonal utilizado y el conjugado enzimático obtenido de la síntesis [7; 8]. Por otro lado, el anticuerpo monoclonal mostro una fuerte afinidad por el conjugado DON-HRP comercial. Las señales obtenidas provinieron exclusivamente de la reacción de reconocimiento antígeno-anticuerpo, en la cual no se observaron uniones inespecíficas del anticuerpo por la HRP ni por ningún otro biorreactivo involucrado en el ensayo. - Se realizó el desarrollo y optimización de cada una de las etapas de un inmunosensor electroquímico directo competitivo utilizando el anticuerpo monoclonal y el DON-HRP comercial, utilizando partículas magnéticas funcionalizadas con la proteína G (MBs-prG) como superficie sólida para la inmovilización del anticuerpo, que permiten mejorar las separaciones y lavados, la eliminación de interferencias de matriz y la localización precisa sobre el transductor electroquímico (electrodo de trabajo). Además en las condiciones fijadas para el desarrollo del inmunosensor, se optimizó la etapa de transducción electroquímica utilizando electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) múltiples como elemento transductor y técnicas amperométricas para medir la extensión de un inmunoensayo competitivo utilizando el enzima peroxidasa (HRP) como generador de la señal analítica. Los errores en la determinación de DON en muestras de harina de trigo certificadas fueron inferiores al 10% y la reproducibilidad del inmunosensor desarrollado es inferior en términos de desviación estándar relativa inferior al 20%. De forma paralela se desarrolló un nuevo procedimiento ELISA basado en la utilización de partículas magnéticas (mELISA), con medida espectrofotométrica de absorción molecular, que permitió optimizar, evaluar y comparar analíticamente un mismo esquema de inmunoensayo utilizando dos tipos de transducción diferentes (óptico y electroquímico). Con este inmunosensor se obtuvieron resultados estadísticamente comparables a los obtenidos con el inmunosensor electroquímico [9]. Las concentraciones determinadas con los inmunosensores desarrollados (detección espectrofotométrica y electroquímica) mantienen una alta correlación con los resultados validados con la metodología oficial (HPLC-UV-Vis), obteniéndose resultados estadísticamente comparables (probabilidad 95%). - Se llevó a cabo la extracción múltiple de micotoxinas provenientes de hongos Fusarium (FB1 y DON) en harinas de cereales de maíz y de trigo, para su determinación con inmunosensores electroquímicos comprobando la influencia del tipo de matriz y del rendimientos de diferentes procedimientos para su extracción múltiple, teniendo en cuenta sus diferentes propiedades químicas. Se buscó mejorar la seguridad alimentaria, realizando una extracción única de varias micotoxinas de una misma muestra, reduciendo así el tiempo y los costes, y determinado posteriormente la concentración de cada una de las micotoxinas inmunosensores individuales [10; 11; 12]. La extracción conjunto de DON y FB1 de una misma matriz de cereales fue satisfactoria, con un rendimiento de extracción próxima al 100%, obteniéndose concentraciones con un error inferior al 5% para cada una de ellas, sin aparecer influencia por el tipo de matriz en las determinaciones. Bibliografía: [1] J.C. Vidal, L. Bonel, A. Ezquerra, S. Hernandez, J.R. Bertolin, C. Cubel, and J.R. Castillo, Electrochemical affinity biosensors for detection of mycotoxins: A review. Biosensors & Bioelectronics 49 (2013) 146-158. [2] G.S. Shephard, E. Berthiller, P.A. Burdaspal, C. Crews, M.A. Jonker, R. Krska, S. MacDonald, R.J. Malone, C. Maragos, M. Sabino, M. Solfrizzo, H.P. Van Egmond, and T.B. 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