Terapia fotodinámica in vitro con Hipericina en hongos causantes de micosis cutáneas

Las infecciones cutáneas o micosis son muy frecuentes, especialmente las causadas por bacterias y hongos. Dentro de las del segundo tipo, denominadas micosis, se encuentran las producidas por hongos dermatofitos o las causadas por levaduras, especialmente por Candida spp. (15). Un uso abusivo de las sustancias antibióticas clásicas, junto con la inapropiada prescripción médica promueven la generación de resistencias de estos microorganismos frente a los agentes antifúngicos. Además, en los últimos años, la elevada densidad de población así como su gran movilidad y el aumento de vectores no humanos han contribuido a la transferencia de microorganismos patógenos entre diferentes nichos ecológicos (12). Estas y otras premisas hacen que sea necesaria la búsqueda de tratamientos alternativos contra este tipo de gérmenes recurrentes. Si bien es aplicable preferentemente al ámbito de los tratamientos sobre lesiones localizadas, la terapia fotodinámica (TFD) (Photo-Dynamic Therapy, PDT), enfocada hacia la erradicación de agentes patógenos infecciosos, representa una seria alternativa a los agentes antibióticos actuales (7). Esta modalidad terapéutica está basada en las propiedades fototóxicas de algunas sustancias denominadas fotosensibilizantes (FSs) y se encuentra ya bien establecida en clínica y foto-diagnosis antitumoral (FDA) (8,11). Aplicada a la inhibición del crecimiento microbiano en términos generales, inicialmente se conoció como fotoinactivación antimicrobiana (FIA) (Photo-Dynamic Inactivation, PDI), la cual demuestra que, por estudios in vivo, puede desvelarse como un arma potencial en el tratamiento contra infecciones provocadas por virus, bacterias y hongos (7). Aplicada a esta índole en el ámbito médico se conoce como (quimio)-terapia fotodinámica antimicrobiana (TFA) (Photo Antimicrobial Chemo-Therapy PACT) (17) o Terapia fotodinámica antimicrobiana (antimicrobial Photo-Dynamic Therapy, aPDT) (18). El fundamento de la reacción fotodinámica que se produce durante la TFA o en la TFD radica en la transferencia de la energía de una radiación visible hasta sustratos biológicos y al oxígeno molecular. En dicha transferencia, la molécula foto-activa, el FS, actúa de intermediario, catalizando la transformación de la energía lumínica a energía química para, así ser asimilable por los sustratos biológicos. Al cargarse de energía, los sustratos aceptores, como el oxígeno molecular o el propio FS excitado, generan especies reactivas, generalmente de oxígeno, entre las que se encuentran el oxígeno singlete, 1O2 el peróxido de hidrógeno, H2O2 o el anión superóxido, O2- (17) o el FS formando un radical, que son capaces de dañar a las células diana a diferentes niveles, ya bien sea por generación de procesos de necrosis (2,16), apoptosis (5,6,9), autofagia (1,13) o combinaciones entre ellas tres (2,16) que concurren en la muerte de las células seleccionadas (3). En este estudio se presenta la actividad antifúngica de un FS natural encontrado en las plantas de la familia del Hipérico, más concretamente en la especie Hipericum perforatum o Hierba de San Juan. Esta sustancia es la Hipericina (HIP), una naftodiantrona con propiedades fototóxicas reconocidas (4). Debido a esos efectos fototóxicos y a su baja genoxicidad, la HIP ha recibido un renovado interés como FS de nueva generación en TFD antitumoral y en la detección de tumores por FDA (10). Objetivos del estudio Objetivo general Evaluar el potencial de la Hipericina (HIP) en la TFD in vitro frente a los hongos que con mayor frecuencia producen patología cutánea: dermatofitos (Trichophyton spp ) y levaduras (Candida spp). Objetivos secundarios ¿ Estudiar de la capacidad antifúngica in vitro de la TFD con HIP como FS sobre las especies de hongos filamentosos y levaduras patógenos cutáneos antes citados. ¿ Estudiar de la capacidad antifúngica in vitro de la TFD con HIP como FS sobre especies de levaduras patógenas cutáneas del género Candida con resistencia a azoles. ¿ Estudiar de la toxicidad por separado de la HIP y de la fuente de luz empleada. ¿ Estudiar de la influencia que ejercen sobre la efectividad de la TFD factores externos, como el pH, la presencia de sales o la clase de medio empleado. ¿ Estudiar del patrón de especies reactivas de oxígeno (EROs) generado durante el proceso de TFD in vitro sobre levaduras. ¿ Estudiar los marcadores de muerte celular por apoptosis generada en la TFD in vitro con HIP. ¿ Estudiar de la sensibilidad de células humanas dérmicas a la TFD in vitro con HIP (queratinocitos HaCaT y fibroblastos hNDF) como mecanismo para describir una posible aplicabilidad de dicha terapia en clínica. ¿ Estudiar de la incorporación de la HIP a levaduras y células humanas a lo largo del tiempo como método para observar la velocidad de asociación del FS con cada tipo de célula. ¿ Estudiar de la localización celular de la HIP en las especies de dermatofitos y levaduras patógenos cutáneos antes citados. ¿ Estudiar de la localización celular de la HIP en células humanas dérmicas. ¿ Comparación de la localización de la HIP con respecto a otros FSs utilizados en los estudios, como el NMB, DMMB o el TMPyP. Metodología A- Instrumentación y reactivos Reactivos: ¿ FS: las disoluciones Stock de HIP fue realizada en Etanol (70 % v/v) o en DMSO y fueron conservada en oscuridad repartida en viales a ¿20 ºC. ¿ Desactivadores / Inhibidores de EROs: Catalasa (CAT), Superoxido dismutasa (SOD) y Azida de sodio (NaN3). Las disoluciones Stock de cada uno fue preparadas en PBS y conservadas en oscuridad a ¿20 ºC. ¿ Sondas celulares: MitoTracker® Green (MTG), CellTracker® Green (CTG), DAPI®, Lysotracker® Green (LTG), Hoechst-33342® y DiOC6®. ¿ Marcadores de citometría de flujo: Dihidroetidio y 7-Antinomicina-D. ¿ Medios de cultivo - Sabouraud® dextrosa agar pH 5,6 ± 0.2 suplementado con Chloranphenicol® a 50 mg/L (SBC). - Medio Sabouraud® dextrosa líquido: fabricación propia con agua destilada (1.000 mL), glucosa (40 g) y peptona bacteriológica (10 g) con Chloranphenicol® a 50 mg/L (SBL). - Medios para cultivo de células humanas (HaCaT y hNDF): Medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM) pH 7,0-7,4 con 4,5 g/L de glucosa, suero fetal bovino (FBS), disolución de penicilina estreptomicina y dislolución de L-glutamina. Lámparas empleadas: - Estudios de TFD in vitro con levaduras y dermatofitos: lámpara LED (Zydoled®) con longitud de onda de 602 ± 10 nm y una irradiancia de 10,3 mWcm-2. - Estudios in vitro con células humanas dérmicas: lámpara LED genérica a 593 ± 10 nm con una irradiancia de 9 mWcm-2. B- Condiciones de cultivo Para la realización de los ensayos se partió de diferentes cultivos atendiendo a las diferentes características de cada célula: - Levaduras: las especies fueron cultivadas en placas de SBC durante 24 h a 35 ºC y en condiciones aerobias. El método de siembra fue por agotamiento. - Dermatofitos: las especies fueron cultivadas de 7-12 días en SBC a 30 ºC en condiciones aerobias. El método de siembra fue por extensión, intentando ocupar todo el volumen de la placa. - Células Humanas: fueron cultivadas durante 2 días a 37 ºC y 5 % de CO2 en medio DMEM suplementado con FBS (10 % vol ¿ vmartes, 6 noviembre 2012ol), L-glutamina y Penicilina-Estreptomicina (1% vol ¿ vol). C- Preparación de inóculos - Levaduras y dermatofitos: Los inóculos fueron realizados empleado un espectrofotómetro con medición en escala McFarland (McF). Todos los inóculos realizados partieron de los cultivos de cada microorganismo ajustados a las condiciones de cultivo antes citadas. Las preparaciones fueron llevadas a cabo bajo condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar. Para el caso de levaduras se empleó como material de partida células de estructura gemante o blastoconidias y para el caso de dermatofitos se partió de la estructura celular tipo espora o microconidios. Dependiendo de la capacidad antifúngica que se quiere evaluar, los inóculos fueron ajustados a unas medidas McF determinadas: 0,5 McF (~1x106 Unidades Formadoras de Colonias (CFU)/mL) para evaluar la inhibición del 99,9% del inóculo inicial, y 4 McF (~1x107 CFU/mL) para el estudio de la inhibición del 99,9999% del inóculo inicial. -Células Animales: Transcurridos 2 días después del cultivo inicial, el 80% de las células confluentes fueron tripsinizadas para despegarlas de los recipientes de cultivo y fueron cultivadas dos días más a 37 ºC en CO2 al 5 % en medio DMEM (con suplementos) en placas de 48 pocillos hasta alcanzar la concentración de ~1x106 células/pocillo D- Estudio de la TFD in vitro con HIP sobre dermatofitos y levaduras Tanto los estudios realizados con levaduras como los de dermatofitos partieron de volúmenes variables de cada inóculo mezclados con disoluciones de HIP para alcanzar diferentes concentraciones del FS. Las muestras fueron mantenidas a oscuridad y a 35 ºC durante diferentes periodos de tiempo (1, 15, 30, 60 min). Tras esto, fueron sometidas a iluminación LED utilizando dosis de luz aproximadas de 18 ó 37 J.cm-2 para levaduras y 37 J.cm-2 para el caso de dermatofitos. Atendiendo a las condiciones de irradiancia de la lámpara empleada, las muestras fueron expuestas a una distancia de 5 cm de la fuente de iluminación durante un tiempo aproximado de 30 min para el caso de 18 J.cm-2 y de 60 min para el caso de la fluencia de 37 J.cm-2. Finalizado el tratamiento fotodinámico, las muestras fueron cultivadas: - Levaduras: en placas SBC durante 48 h a 35 ºC, en condiciones aerobias y realizando una siembra por extensión. - Dermatofitos en placas de SBC durante al menos 96 h a 30 ºC, en condiciones aerobias y con siembra por extensión. Las placas fueron precintadas con parafilm para evitar la deshidratación del medio. En estos tipos de ensayos se utilizaron tres tipos de controles: - Control 1. Inóculo inicial sin iluminación LED y sin FS: Control de referencia respecto del cual se refieren los resultados de las muestras tratadas con TFD. - Control 2. Inóculo inicial con iluminación LED y sin FS: evaluación de la toxicidad de la luz. -Control 3. Inóculo inicial sin iluminación LED y con FS: evaluación de la toxicidad del FS en oscuridad. Uso de las concentraciones empleadas del FS que provocaron la inhibición deseada para cada caso. El efecto de inhibición deseado sobre las cepas fue evaluado contando el número de colonias en las placas de muestras y control. Con ello se estableció la concentración CFU/mL antes y después de la terapia con lo que se pudo establecer el % de inhibición (Pagonis TC et al. J. Endod. 36: 322¿328 ). Para establecer la inhibición en términos de actividad fungicida, fue adoptado el criterio utilizado para definir la actividad bactericida, establecido en una inhibición del 99,9 % o reducción de 3 unidades logarítmicas (3 Log) con respecto a la muestra inicial. Este criterio ya ha sido utilizado previamente en otras publicaciones para asegurar la actividad antifúngica de fármacos frente a Candida spp. Este criterio fue aplicado sobre los experimentos en los que fueron empleados los inóculos correspondientes a un 0,5 en la escala McF (Ernst E et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2002, 46:578¿581 ). La inhibición actividad antifúngica consistente en la reducción del 99,9999% del inóculo inicial, o reducción de 6 Log, fue un criterio más riguroso que fue empleado para averiguar la magnitud de inhibición posible de la terapia en comparación con el daño fototóxico que podría provocar sobre las células humanas. Este criterio fue aplicado sobre los experimentos en los que fueron empleados los inóculos correspondientes a un 0,5 en la escala McF. Los valores de supervivencia fueron expresados en medias ± las desviaciones Standard (SD). Las representaciones gráficas se refirieron a la disminución de unidades logarítmicas con respecto al inóculo inicial (Control 1). Los experimentos fueron llevados a cabo al menos nueve veces (tres días diferentes y por triplicado). E- Estudio de la formación de especies reactivas de oxígeno (EROs) durante la TFD in vitro con HIP sobre Levaduras Los estudios partieron con volúmenes variables de cada uno de los inóculos correspondientes a la medida de 0,5 en la escala McF mezclados con las disoluciones que contenían los desactivadores de las EROs cada uno por separado. Las muestras se incubaron en oscuridad durante 15 min a 35 ºC. Tras la incubación, se añadió la cantidad HIP a cada muestra para alcanzar la concentración que provoca una reducción de 3 Log en cada especie con respecto al inóculo inicial obtenida en el apartado D de la metodología. Las muestras con la HIP recién añadida se irradian inmediatamente utilizando una fluencia aproximada de 18 J.cm-2. Finalizado el tratamiento fotodinámico, las muestras fueron cultivadas totalmente en placas SBC durante 48 h a 35 ºC, en condiciones aerobias y realizando una siembra por extensión. Para la realización de este ensayo se emplearon los mismos controles que en el apartado D de metodología más un control adicional de toxicidad de la NaN3 sin iluminación LED ni FS. Tanto el análisis de los controles, como el de las muestras del estudio fueron evaluadas por contaje de las CFU por placa y referidas a CFU/mL. La actividad foto-protectora de los quenchers frente a la TFD in vitro fue referida respecto al inóculo inicial (Control 1). Se realizó un estudio adicional de detección de especies reactivas de oxígeno mediante el uso de citometría de flujo empleando dihidroetidio para detectar la presencia de anión superóxido. Este experimento fue realizado en la especie más sensible y en la más resistente a la TFD con HIP. F- Estudio de marcadores de apoptosis generados en la TFD in vitro con HIP Fueron realizados estudios de citometría de flujo mediante el uso de 7-Antinomicina-D para detectar permeabilidad de membranas celulares. Adicionalmente, se realizó un marcaje de las células con un marcador nuclear (Hoechst) y se observaron al microscopio para detectar fragmentación y condensación de cromatina, característica del fenotipo apoptótico. Este experimento fue realizado en la especie más sensible y en la más resistente a la TFD con HIP. H- Estudio de la TFD in vitro con HIP sobre células humanas Un inóculo de 1x106 células/ pocillo de cada tipo celular, crecido con las condiciones descritas más arriba, y mezclado con diferentes cantidades de HIP para asegurar diferentes concentraciones de la misma, se irradia utilizando diferentes fluencias (8, 18 y 37 J.cm-2). Atendiendo a las condiciones de irradiancia de la lámpara empleada, las muestras fueron expuestas a una distancia de 5 cm de la fuente de iluminación durante un tiempo aproximado de 15 min para el caso de 8 J.cm-2, de 35 min para el caso de 18 J.cm-2 y de 70 min para el caso de la fluencia de 37 J.cm-2. Estudio de la viabilidad celular por ensayo MTT: las células se lavan para eliminar el exceso de HIP y se incuban con MTT 24 h a 37 ºC. Después de la incubación, el medio se reemplaza por DMSO, y la suspensión resultante se agita durante 15 min. Finalmente, se mide la absorbancia a 550 nm con un lector de microplacas. En el experimento se realizaron controles que fueron encaminados exactamente al mismo fin que los utilizados en los apartados de TFD in vitro con y con levaduras. Los valores fueron expresados en medias ± las desviaciones Standard (SD). Las diferencias entre dos medias fueron analizadas utilizando el test Mann¿Whitney U. La significancia estadística fue aceptada a valores de P < 0.05. I- Uptake; estudio de la incorporación de la HIP en levaduras y en células humanas. El uptake de la HIP en levaduras se realizó partiendo de inóculos de 1x106 CFU/mL en una disolución con la HIP que fueron mantenidos en oscuridad durante diferentes periodos de tiempo, teniendo una muestra diferente para cada tiempo (30 min, 1, 3, 5, 7, 18, 19 y 24 h) a una temperatura de 37 ºC y en condiciones de agitación suave. Pasado cada tiempo de incubación, se elimina el exceso de HIP no asociada o internalizada en las células. Posteriormente, se procedió al lisado celular del pellet final, resuspendiéndolo en una disolución de SDS en agua al 2% con agitación suave durante 24h a temperatura ambiente y en oscuridad. El uptake de la HIP en células humanas partió de inóculos de concentración de 1x106 células/ pocillo con HIP que fueron incubados en oscuridad durante diferentes periodos de tiempo, teniendo una muestra para cada tiempo ( 30 min, 1, 2, 6, 8, 18 y 24 h) a 37 ºC y con una atmósfera de CO2 del 5 %. Pasado cada tiempo de incubación se retiró la HIP presente en el medio y no asociada o internalizada en las células. Tras esto, las células fueron raspadas para separarlas del pocillo y lisadas con una disolución de SDS al 2 % en agua y con agitación suave durante 24 h a temperatura ambiente y en oscuridad. La cantidad de FS incorporado por las células a cada tiempo de incubación fue obtenida por espectroscopia de fluorescencia excitando cada lisado a 530 nm y recogiendo el espectro de emisión (fluorescencia) en el rango de 550-750 nm. Fue utilizado un método de integración (Jobin-Yvon Spex Fluoromax 4 spectrofluorometer) para calcular el área bajo la curva de cada espectro de fluorescencia a cada diferente tiempo de contacto del FS con las células. Los valores de intensidad de la fluorescencia obtenidos para cada muestra fueron referidos por normalización al número total de células en cada pocillo para corregir las variaciones existentes entre las diferentes muestras. Para este fin se utilizó el ensayo ¿bicinchoninic acid protein¿ (BCA) o también llamado ensayo de Smith (Smith PK et al. Anal Biochem. 1985, 150(1):76-85). Todos los experimentos fueron realizados por triplicado para asegurar la veracidad de los resultados. J- Estudio de la localización de la HIP por microscopía de fluorescencia Localización de HIP en levaduras y dermatofitos Se parte de inóculos de cada germen realizados en medio Sabouraud líquido con una medida de 0,5 unidades en la escala McF, correspondientes a una concentración de ~1x106 CFU/mL. Las células se resuspenden en una disolución con HIP y se mantienen en oscuridad a 35 ºC durante diferentes periodos de tiempo (1, 30 min y 24 h). Transcurrido el tiempo de incubación, se lavan las células para eliminar la HIP no adherida o no han penetrado en ellas. Tras el lavado, las células son resuspendidas en una disolución que contendrá, bien la sonda mitocondrial (MitoTracker Green, MTG), bien la sonda citoplasmática (CellTracker Green, CTG). La mezcla de las células con la sonda se incuba 40 min y a unas concentraciones de sonda determinados por la condiciones del fabricante. Tras lavar el exceso de sondas, las muestras se fijan en una disolución de para-formaldehido (PFA) al 3 %. Las células fijadas son lavadas y posteriormente adheridas a cubreobjetos redondos impregnados con poly-lisina por centrifugación y se montan sobre portas con Mowiol como medio de montaje, el cual contiene la sonda nuclear DAPI. Localización de HIP en queratinocitos y fibroblastos humanos Se incuban las células sobre cubreobjetos (tratado previamente con glicerina) en medio de cultivo DMEM suplementado durante 2 días a 37 ºC y 5 % de CO2 hasta alcanzar 1x106 células/mL. Se retira el medio por lavados y se añade medio fresco con HIP. Se realiza una incubación en oscuridad durante 1 h a 37 ºC y 5 % CO2. Se retira el exceso de HIP no asociada por lavados y se añaden las sondas celulares a la concentraciones de trabajo establecidas (Hoechst, MTG y LysoTracker Green (LTG)) por separado y se incuban con agitación orbital, siempre a oscuras. Se elimina el exceso de sondas por lavado y se extrae el cubreobjetos del pocillo, se deposita una gota de glicerol sobre el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos invertido sobre el portaobjetos. En este momento las muestras ya están preparadas para ser examinadas en el microscopio. Todas las muestras fueron visualizadas con un microscopio de escaneado confocal Olympus Fluoview FV10i. Las imágenes fueron recogidas utilizando el modo secuencial del microscopio con el objetivo de aceite de inmersión 63x y con calidad de 1024x1024 píxeles, empleando diferentes modalidades de zoom digital para amplificar la imagen. Las imágenes fueron exportadas desde el software del microscopio FV10i a Adobe Photoshop Illustrator para realizar las figuras