Susceptibilidad in vitro de microorganismos de la cavidad oral frente a la terapia fotodinámica

Introducción: La boca es el hábitat favorable para más de 300 especies de bacterias y algunos hongos debido a la presencia de nutrientes, restos de epitelio y secreciones. La distribución de la microbiota varía cualitativa y cuantitativamente de acuerdo con el hábitat. Los biofilms microbianos en la cavidad oral están involucrados en la etiología de diversos procesos orales, que incluyen enfermedades periodontales y endodontales, caries, halitosis, estomatitis, candidiasis así como el fracaso de implantes dentales. Por otro lado, las bacterias de la placa dental son capaces de iniciar una endocarditis bacteriana, en pacientes predispuestos, así como que se las ha relacionado con partos prematuros, infecciones uterinas, diabetes e incluso demencia. En general, se acepta que el crecimiento de las bacterias en biofilms les confiere a estos gérmenes orales una menor susceptibilidad a los agentes antimicrobianos comparado a su crecimiento en cultivos en suspensión (forma planctónica). Por dicha razón, no sorprende que las bacterias que crecen en la placa dental, que de forma natural lo hacen en forma de biofilm presenten crecientes resistencias a los antimicrobianos. Los agentes antimicrobianos, antibióticos y no-antibióticos, se prescriben frecuentemente para el tratamiento de la halitosis y la enfermedad periodontal. No obstante, el riesgo de resistencias y toxicidad es un problema importante. Además, sólo altos niveles y múltiples dosis de los mismos administrados localmente pueden tener el mismo efecto que los que se administran por vía sistémica. Por todo ello, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas diferentes a las hasta ahora utilizadas supone un importante reto para el control del crecimiento microbiano en la cavidad oral. Una de las nuevas estrategias terapéuticas es la terapia fotodinámica antimicrobiana (TFA), la terapia fotodinámica puede emerger como un proceso adecuado para combatir tanto la biopelícula y resistencia a los antimicrobianos relacionada, que combina un colorante no tóxico, denominado fotosensibilizante, que es activado por una la luz visible de longitud de onda apropiada que va a producir especies del oxígeno reactivo (ROS) (Iriana Carla y cols 2005). Objetivos: explorar la eficacia de la terapia fotodinámica (TFD) con la hipericina (HYP) comparándola con la de uno de los fotosensibilizantes más utilizados en TFD antimicrobiana, el azul de metileno (AM), frente a los microorganismos patógenos que con mayor frecuencia producen infecciones en la cavidad oral: bacterias gram positivas (Streptoccocus sanguis y Streptoccocus mutans) y levadura (Candida albicans). 3. Material Cepa del estudio Bacterias: • S. mutans (ATCC 35668) • S. sanguis (ATCC 10556) Levaduras: Candida albicans American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA (ATCC) 10231 Cepas resistentes: • C. albicans (456325H) • C. albicans (AZN-4635) • C. a albicans (AM0Z 0267) Células: • queratinocitos humanos ( HaCaT) • fibroblastos humanos normales (hNDF) 3.1.2. Fotosensibilizantes (FSs): • Hypericin from Hypericum perforatum 95% (HPLC) SIGMA. • Methylene blue SIGMA. 3.1.3. Reactivos y disolventes: • Tampón PBS BIO-RAD • Aqua ad Iniectabilia MEINSOL (agua destilada y desionizada). • Sabouraud Dextrose Agar CM0041 OXOID. • Columbia Agar Sangre OXOID. • Alcohol etílico a 70º ALCOHOCEL • Cloramfenicol SIGMA • Medio DMEM, FBS 10%, con antibiótico.Dulbecco's 3.1.4. Sondas inmunofluorescentes: • Cell tracker green 1000M (Tinción celular general) Invitrogen (Molecular Probes). • Mitotracker (Tinción de mitocondrias) Invitrogen (Molecular Probes). • DAPI (Tinción nuclear) Invitrogen (Molecular Probes). • DIOC (Tinción de mitocondrias) Invitrogen (Molecular Probes). • Lisotracker (Tinción lisosomas) Invitrogen (Molecular Probes). 3.1.5. Instrumentación: • Lámpara de diodos ámbar, con pico de emisión a 602+10 nm; 37J/cm2, 10,3 mW/ cm2. • Lámpara de diodos de luz roja, con pico de emisión a 590+10 nm; 19 mW/ cm2. • Lámpara de halogenuro metálico de luz blanca, con espectro de emisión entre 420 a 700 nm. • Colorímetro con escala McFarland DINKO • Asa de siembra Digraski • Campana de flujo laminar Telstar BIO II A. • Placas de cultivo STERILIN. Tratamiento fotodinámico Preparación de las siembras de cada germen: Las siembras de S. mutans y sanguis se realizan partiendo de un liofilizado comercial o la de C.albicans proporcionados por Dr Meis del Canisius Wilhelmina Hospital, Nijmegen, The Netherlands que fueron previamente cultivados y archivados en leche descremada conservándose a una temperatura de -80ºC. La resiembra a partir de los archivos se realizó mediante el método de siembra por agotamiento. Preparación inóculo para levaduras: Se realizó un cultivo del género Candida en agar Sabouraud-cloranphenicol (SBC), se incubó 24 horas a 35ºC. A partir del cultivo se utiliza para realizar el inóculo. Se realizó un inóculo de 4 McFarland (McF) debido a que queremos disminuir 6 unidades logaritmicas (unid. log.). y necesitamos un mínimo de 106 células Estas medidas se realizaron con el espectrofotómetro. Preparación inóculo para bacterias: Se realizó el cultivo del género Streptoccocus spp utilizando un medio de agar sangre Columbia, posteriormente, se incubó 24 horas a 37ºC con una atmosfera del 5% de CO2. De esa resiembra se utiliza para realizar el inóculo, a 0.5 McFarland, medidas que se realiza con el espectrofotómetro. Realización ensayos Se coge una placa microtitter de 96 pocillos en la que en cada pocillo se inocula con 90µL de la suspensión del inóculo y se le añade diferentes cantidades de disolución de los diferentes FSs para obtener las diferentes concentraciones deseadas, una vez echado todas las cantidades del FS se rellena el pocillo hasta 100µL con agua. Una vez finalizado este paso se agita bien cada pocillo para que se mezcle y haya un mejor contacto microorganismo-fotosensibilizante. Irradiación: una vez han sido preparados los diferentes pocillos en la placa microtitter se procede al proceso de irradiación. Los distintos microorganismos serán expuestos a una lámpara de diodos de longitud de onda adecuada (590+10 nm para la hipericina y 630 +10 nm para las fenotiacinas). La dosis de luz administrada irá de 0 a 37 J/cm2. Para conseguir esta dosis de luz se colocarán las lámparas a una distancia de 5 cm sobre la placa microtitter variándose el tiempo para conseguir la fluencia deseada, 30 y 60 minutos respectivamente para administrar 18 y 37 J/ cm2 en el caso de la hipericina y 15 y 30 minutos respectivamente en el de las fenotiacinas. Medición de la fotoinactivación producida con los distintos fotosensibilizantes. Terminado el proceso de irradiación de las muestras, se procede a la siembra de las mismas en las placas de siembra. Para establecer el daño fotodinámico, la viabilidad de los gérmenes se estudiará por su capacidad de formar colonias tras la TFD subcultivándolas en diferentes medios dependiendo del microrganismo. Se hará un recuento de número de colonias obtenido, comparándolas con el número obtenido en las placas de control: antes de la irradiación incubadas con FS y no iluminadas, no incubadas con FS e iluminadas y no incubadas con FS ni iluminadas. El recuento se hará tras la incubación, dependiendo de la especie (24h S. sanguis y 48 horas las levaduras y S. mutans). Para medir el efecto bactericida o fungicida tiene que haber una disminución de 6 unidades logarítmicas que significa que el fotosensibilizante mata al > 99,9999% de las células. Los experimentos se realizaran por triplicado se repite al menos 3 veces para comprobar su reproductibilidad. Fotoinactivación combinada usando 2 fotosensibilizantes En la placa de microtitter de 96 pocillos, se quiere realizar la combinación de dos fotosensibilizantes y por ello se va a llevar a cabo de forma de “tablero de ajedrez” adaptado. Arriba se hace un barrido de concentraciones de un fotosensibilizante, las concentraciones van de menor a mayor, de izquierda a derecha (fila), el otro FS se utiliza el mismo criterio pero de arriba abajo (columna). Al rellenar los pocillos se echan las cantidades por columnas o por filas por tanto todo los pocillos de la placa tendrán una concentración diferente de cada fotosensibilizante. Una vez finalizado este paso se agita bien cada pocillo para que se mezcle y haya un mejor contacto microorganismo-fotosensibilizante y se irradia. Los distintos microorganismos serán expuestos a una Lámpara de halogenuro metálico de luz blanca, con espectro de emisión entre 420 a 700 nm. La dosis de luz administrada irá de 0 a 37 J/cm2. Para conseguir esta dosis de luz se colocará la lámpara a una distancia de 10cm sobre la placa microtitter variándose el tiempo para conseguir la fluencia deseada, 3min 20s y 6min 51s respectivamente para administrar 18 y 37 J/ cm2. Localización de fotosensibilizante en el germen: los experimentos se realizaron en el clínico utilizando técnicas de microscopía confocal bajo la supervisión de la Dra. María Royo.Estudio de la localización celular de hipericina en Candida spp. El objetivo de este experimento fue comprobar que la hipericina penetra en el interior de las células de levaduras mediante estudios de coalescencia con fluoróforos intracelulares con longitudes de onda de emisión diferentes a la de la propia hipericina. Además se intentó determinar en qué lugar de la célula se localiza dicho FS mediante el uso de marcadores mitocondriales y nucleares. Este estudio no se pudo realizar en bacterias con los medios de los que disponemos dado su pequeño tamaño debido al que tamaño oscila entre 0.7 y 0.9 µm de diámetro comparado con las medidas de candida que se encuentran entre los 2-4 µm o las de fibroblastos o queratinocitos que pueden oscilar de 7-10 µm. Estudio de la toxicidad de la TF con hipericina sobre queratinocitos y fibroblastos: La viabilidad de las células HaCaT y hNDF tras el tratamiento con hipericina se estudiará mediante el ensayo MTT para establecer los efectos adversos de dicho tratamiento sobre las células sanas de la mucosa oral. Células (típicamente a una concentración 106) se cultivarán en microplacas de 48 pocillos a 37ºC y 5% CO2 usando DMEM (FBS 10% v/v, L-glutamina 2mM, Penicilina estreptomicina 1% v/v) como medio de cultivo. Después de lavar con PBS, se incubarán con concentraciones crecientes de hipericina: 0.5, 1, 5 and 10 µM) y se irradiarán con una lámpara de LEDs de 590 nm durante, 30 y 60 minutos, correspondiente a dosis de luz de 18 and 37 J•cm-2, respectivamente 28. Las células entonces se lavarán con PBS se eliminará cualquier exceso de hipericina y se realizará el ensayo MTT a las 24 h. La toxicidad en oscuridad y la toxicidad de la luz serán los controles del experimento en las mismas condiciones Localización de fotosensibilizante en fibroblastos y queratinocitos Traspaso celular y preparación de placas. Se trabaja en campana estéril (etanol 70°, UV) y con flujo constante. La placa de 60 mm debe tener una confluencia de 70-80% de las células. Una vez tengamos esas condiciones se extrae el medio con una pipeta. Agregar 1 ml de buffer PBS 1x, suavemente, evitando que se despeguen las células. Dejar 30 segundos, y retirar el buffer. Agregar 300 µl de tripsina 2.5% (diluida con 900 ul de PBS 1x) y dejar reposar 3-5 minutos dentro de la incubadora. Despegar las células de la placa dándole unos golpecitos y traspasar a placa de 6 pocillos para poder continuar con el experimento. Localización en microscopio: los experimentos se realizaron en la Universidad Autónoma de Madrid en la Facultad de Ciencias, utilizando técnicas de microscopía de fluorescencia bajo la supervisión de la Dra. Ángeles Juarranz. Se realizó un cultivo de células de la piel a partir de una biopsia cutánea de piel normal obtenida de un voluntario sano Las células se cultivaron en microplacas de 6 pocillos a 37ºC y 5% CO2 usando DMEM (FBS 10% v/v, L-glutamina 2mM, Penicilina estreptomicina 1% v/v) como medio de cultivo. Una vez la placa tuviese una confluencia al 70% se incubaron con concentraciones crecientes de hipericina 2 y 5 µM durante dos periodos de tiempo: 5 y 24 horas. Se utilizaron sondas para la inmunohistoquimica como el DIOC y Lisotracker a una concentración de 5 µM. Posteriormente se procedió a la observación microscópica y toma de imágenes. La microscopía de fluorescencia se realizó utilizando un microscopio Olympus BX61 acoplado a una cámara de captura digital Olympus DP50