Células madre mesenquimales equinas: Obtención y análisis de sus propiedades in vitro

Las células madre mesenquimales (MSCs) presentan una capacidad de autorrenovación y diferenciación a linajes derivados del mesodermo que las hacen idóneas para su aplicación en el tratamiento de lesiones del aparato locomotor en la especie equina. Las lesiones más comunes que sufren los caballos de carreras afectan a tejidos como el tendón o cartílago, que presentan una capacidad muy limitada de reparación. Las MSCs pueden contribuir a la formación de un tejido con propiedades similares a las del tejido sano y evitar así el riesgo de recaídas. Para poder aplicar con garantías las MSCs a la clínica equina es fundamental el conocimiento de sus características. Por ello, en el presente trabajo de Tesis Doctoral se han estudiado las características de las MSCs equinas derivadas de médula ósea (BM-MSCs) y tejido adiposo (AT-MSCs) tanto en condiciones estándar de cultivo (20% O2), como en condiciones denominadas de hipoxia (5% O2), más similares a la concentración de oxígeno fisiológica que rodea a las células in vivo. Antes de caracterizar las MSCs se realizó un ensayo para valorar la influencia del tiempo que transcurre entre la toma de muestras y el aislamiento de las células sobre su capacidad de autorrenovación. El retraso sufrido en el aislamiento de las células supuso una pérdida de MSCs, ya que el número de colonias obtenidas fue significativamente mayor cuando el aislamiento se llevó a cabo inmediatamente después a la obtención del tejido que 24 horas después. A continuación se estudió la capacidad de proliferación de las MSCs y su potencial de diferenciación hacia linajes osteogénico y adipogénico. Los resultados mostraron que las AT-MSCs dieron lugar a mayor número de células en cultivo que las BM-MSCs. Ambos tipos celulares se diferenciaron hacia osteoblasto, presentando un limitado potencial adipogénico. Posteriormente se determinó el fenotipo de las BM-MSCs y AT-MSCs respecto a la expresión de ciertos marcadores de superficie por citometría de flujo y PCR cuantitativa en tiempo real. Las MSCs equinas mostraron un perfil de expresión similar al de la especie humana, observándose diferencias en la expresión de ciertos marcadores entre BM-MSCs y AT-MSCs. Por otra parte, el cultivo en condiciones de hipoxia no modificó la capacidad de expansión, fenotipo o potenciales osteogénico y adipogénico de las BM-MSCs. Sin embargo, la condrogénesis se vio potenciada por esta condición. El estudio de la evolución del ciclo celular y la viabilidad de las MSCs de ambos orígenes en las dos condiciones de oxígeno mostró que los cultivos en normoxia presentaron mayor número de células, debido a una mayor actividad en la división celular en las BM-MSCs y a una mayor viabilidad de los cultivos de las AT-MSCs. Además, las MSCs mostraron una tendencia a una mayor expresión de marcadores de pluripotencia en hipoxia, lo que indicaría que estas células se encontraban en un estado menos diferenciado. Las diferencias en las características de las MSCs in vitro podrían estar relacionadas con variaciones en su capacidad terapéutica in vivo. Por ello, y como parte de un estudio pre-clínico de tratamiento de lesiones tendinosas en caballos, se analizó el fenotipo y potencial de diferenciación osteogénico, adipogénico y condrogénico de las BM-MSCs y AT-MSCs utilizadas en dicho estudio. Los resultados confirmaron los obtenidos anteriormente para el fenotipo y potencial osteogénico. Además, ambos tipos celulares mostraron similar capacidad de diferenciación adipogénica. Sin embargo, en nuestras condiciones experimentales, aunque las BM-MSCs se diferenciaron claramente hacia condrocito, las AT-MSCs mostraron un limitado potencial de diferenciación hacia ese linaje