Desarrollo de métodos moleculares para la detección de fraudes alimentarios.

Las fuertes crisis alimentarias sufridas por la sociedad europea originadas por enfermedades transmitidas por alimentos, condicionaron que todos los sistemas de seguridad y salud existentes fueran puestos en duda, con repercusiones sin precedentes en todos los sectores, demandando a las autoridades garantías en cuanto a la calidad, seguridad y veracidad del etiquetado. A consecuencia de ello, en los últimos años se ha evidenciado un interés creciente por determinar el origen y contenido de los productos destinados al consumo, con especial énfasis en las especies animales y vegetales declaradas o no en los productos elaborados, requiriendo para cumplir con los objetivos reguladores y proteccionistas, el empleo de métodos sensibles, selectivos, rápidos, automatizables, económicos y fáciles de usar. La identificación y cuantificación de especies en alimentos se aborda en la práctica mediante la detección de proteínas y/o secuencias de ADN específicas de especie, presentando esta última ciertas ventajas frente a los métodos basados en proteínas. Entre las metodologías génicas, una de las opciones más versátiles se centra en la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo final para la identificación de ADN (screening) y a tiempo real (qPCR), para determinar y cuantificar el ADN presente en muestras complejas. De las diferentes variantes metodológicas de la qPCR destacan los sistemas basados en el empleo de sondas fluorescentes específicas. Desde hace algunos años se emplea una variante de las sondas fluorescentes de hidrólisis habituales, que presenta mayor afinidad por el surco menor del ADN (MGB) para determinaciones de polimorfismos en aplicaciones biomédicas, que pueden ser de aplicación en la identificación y cuantificación de especies en alimentos, permitiendo amplificar incluso en alimentos procesados, moléculas de ADN muy fragmentado, y detectar al mismo tiempo variaciones entre especies filogenéticamente próximas y entre variedades dentro de una misma especie, mediante el análisis de polimorfismos de un único nucleótido. Así, en esta tesis se han desarrollado detectores adecuados para diferenciar mamíferos (ternera, cerdo) y aves (pavo, pollo) en muestras frescas y procesadas, utilizando como estándar de referencia para normalizar las concentraciones, los valores de CT obtenidos para una mezcla 50:50 de vaca/cerdo o pavo/pollo, reduciendo así el número de estándares requeridos. Esta aproximación permite obtener un valor realista de la diferencia en el número de copias de la secuencia diana por unidad de masa del material empleado para cada especie, pudiendo normalizar de forma sencilla, los datos obtenidos mediante qPCR a porcentajes de material de cada especie en las muestras. Estos materiales de referencia son adecuados para el análisis de alimentos procesados, ya que se pueden someter al mismo tratamiento que las muestras a ensayar. Además, se ha abordado el problema de la discriminación de especies filogenéticamente muy próximas o variedades dentro de una misma especie, abordando la diferenciación de naranja y mandarina en zumos. El método puesto a punto se basa en la utilización de un juego de cebadores comunes para las dos especies y dos sondas TaqMan® MGB que se diferencian en una sola base, correspondiente al polimorfismo que identifica cada especie. Los resultados obtenidos evidencian que el método de qPCR permite establecer un límite de detección útil para mandarina, diferenciando entre ingrediente y contaminación; si bien, se aconseja que el procedimiento de análisis vaya acompañado de suficientes reacciones control con materiales de referencia para evitar errores de cuantificación debido a la variabilidad asociada a las medidas. También se llevó a cabo la validación de un protocolo de PCR, en todas las matrices alimentarias que aparecen en el Codex Alimentarius y piensos, mostrando un LOD de 0,1% frente a material de referencia certificado, para la identificación de las secuencias P35S y TNOS. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis resaltan la importancia del empleo de materiales de referencia adaptados a la matriz a analizar, tanto en aplicaciones cualitativas como cuantitativas, a diferencia de otras propuestas que requieren la elaboración de una colección de muestras de referencia con distintas proporciones de la especie a detectar en la mezcla, obteniendo datos fiables utilizando una única muestra de referencia con contenido conocido de las especies a analizar (50% de cada una). Esta aproximación puede simplificar la puesta a punto y validación de métodos de análisis particularizados para cada tipo de matriz, facilitando la introducción y consolidación de los sistemas de identificación genética en alimentos.Ciencias de la Alimentació