Linear and circular polarization-resolved SHG microscopy to characterize the 3D organization of collagen

Le collagène est un élément majeur de l'architecture des organes chez les mammifères où il forme diverses structures tridimensionnelles (3D) propres à chaque tissu. La visualisation de cette organisation 3D multi-échelle est cruciale pour comprendre la structuration d'organes tels que la cornée ou la peau et guider l'ingénierie de tissus artificiels, qui doivent être structurés de manière appropriée pour être fonctionnels. L’organisation du collagène est de plus affectée dans de nombreuses pathologies. Caractériser ces désordres tissulaires in situ de manière quantitative constitue ainsi un enjeu biomédical majeur.La microscopie SHG est reconnue depuis plusieurs années comme la technique de référence pour imager le collagène fibrillaire in situ dans des tissus sans marquage, et ceci avec un excellent contraste. Cette thèse présente la mise en place et l'application de nouvelles modalités de microscopie SHG fondées sur la polarisation, visant à obtenir des paramètres fiables et quantitatifs pour décrire plus précisément la structure tridimensionnelle du collagène.Tout d’abord, nous présentons une modalité utilisant des polarisations incidentes linéaires (P-SHG) pour analyser l’organisation multi-échelle du collagène dans divers tissus, sains et pathologiques. Ces analyses ont été conduites sur des objets du patrimoine (parchemins, constitués de collagène de peaux animales) ainsi que sur des tissus biologiques (cornées). D’une part, tirant parti du caractère non invasif de cette modalité, nous caractérisons la dégradation du collagène dans des parchemins, précieux objets d’art et d’Histoire, démontrant ainsi l’intérêt de la microscopie SHG dans le domaine du patrimoine, notamment pour des diagnostics de l’état de conservation des objets riches en collagène. D’autre part, une imagerie quantitative de cornées humaines saines est présentée, et comparée à des cornées présentant un kératocône, pathologie courante aujourd’hui. Des modèles murins de kératocônes cornéens sont également étudiés, dans le but de valider leur pertinence.Enfin, une modalité utilisant des polarisations incidentes circulaires pour mesurer des signaux de dichroïsme circulaire (CD-SHG) est exposée. Dans un premier temps, nous présentons la mise en place expérimentale rigoureuse de cette modalité, en identifiant et corrigeant des artefacts typiques de cette technique. Dans un second temps, nous proposons une nouvelle approche théorique pour décrire les signaux de CD-SHG. Les simulations numériques de l’expression analytique obtenue sont comparées aux résultats expérimentaux, dans le but de comprendre l’évolution des signaux de CD-SHG en fonction de l’architecture 3D du collagène.Collagen is a major component of organ architecture in mammals where it forms various three-dimensional (3D) structures specific to each tissue. The visualization of this multi-scale 3D organization is crucial to decipher the structure of organs such as the cornea or the skin and to guide the engineering fully functional tissue substitutes. Moreover, the organization of collagen is also affected in many diseases, so that in situ quantitative characterization of such disorders is a major biomedical issue.SHG microscopy has been recognized for several years as the gold-standard technique for imaging fibrillar collagen in situ in unmarked tissues with excellent contrast. This thesis presents the development and the application of new polarization-based SHG microscopy modalities to obtain reliable and quantitative parameters in order to more accurately describe the three-dimensional structure of collagen.First, we present a modality using linear incident polarizations (P-SHG) to analyze the multi-scale organization of collagen in various tissues, healthy and pathological. These analyses were carried out on cultural heritage objects (parchments, made of collagen from animal skins) as well as on biological tissues (corneas). On one hand, taking advantage of the non-invasive nature of this modality, we characterize the degradation of collagen in ancient parchments, precious objects of art and history. This proves the interest of SHG microscopy in the field of cultural heritage, particularly to decipher the state of conservation of objects rich in collagen. On the other hand, quantitative imaging of healthy human corneas is presented, and compared to corneas with keratoconus, a common pathology today. Murine models of corneal keratoconus are also being studied to validate their relevance.Finally, a modality using circular incident polarizations to measure circular dichroism signals (CD-SHG) is exposed. First, we present the rigorous experimental implementation of this modality, by identifying and correcting typical artifacts of this technique. Secondly, we propose a new theoretical approach to describe CD-SHG signals. Numerical simulations of the obtained analytical expression are compared to experimental results in order to understand the evolution of CD-SHG signals with the 3D architecture of collagen