Bases moléculaires des anomalies cérébelleuses congénitales et modélisation de la déficience en N-glycosylation des protéines

Les anomalies cérébelleuses englobent un groupe de maladies rares affectant le fonctionnement du cervelet. La prévalence de ces défauts est estimée à 26 sur 10000 enfants en Europe. Ces maladies entraînent des troubles du mouvement (ataxie) et sont fréquemment associées à des déficiences intellectuelles, des défauts qui empêchent les patients touchés d'avoir une vie normale et qui peux entrainer une mortalité précoce. Pour la plupart de ces conditions, seul un traitement symptomatique est disponible. Outre le diagnostic génétique, utile pour faire face à de nouvelles grossesses, une compréhension profonde de la physiopathologie sous-jacente à l'anomalie est nécessaire pour le développement potentiel des thérapies. Mon travail de thèse avait pour but l'amélioration du diagnostic génétique des défauts cérébelleux et la compréhension de la physiopathologie de l'une des causes les plus fréquentes d'anomalies cérébelleuses : la perturbation de la N-glycosylation des protéines. La perturbation de la N-glycosylation des protéines est à la base des syndromes CDG (troubles congénitaux de la glycosylation ou «congenital disorders of glycosylation»), maladies multisystémiques avec des troubles neurologiques sévères. Une atrophie et une hypoplasie cérébelleuses précoces sont fréquemment observées, en particulier dans les cas des CDG avec des mutations au gène SRD5A3. Pour mieux comprendre comment un défaut général de N-glycosylation affecte le développement cérébelleux, nous avons généré une souris Srd5a3 KO conditionnelle au niveau du cervelet. Ce modèle récapitule le défaut humain avec une N-glycosylation anormale, une hypoplasie cérébelleuse et une altération de la coordination motrice. Une évaluation histologique précise du cervelet a montré que certaines cellules granulaires étaient incapables d'initier leur migration finale lors du développement du cervelet. En combinant une approche protéomique et une approche glycoprotéomique, nous avons montré qu'un défaut de N-glycosylation a un impact variable en fonction du nombre de sites de N-glycosylation sur chaque protéine. Plus le nombre de sites de N-glycosylation d'une protéine est élevé, plus elle est sensible à l'hypoglycosylation et/ou à la dégradation dans un contexte de CDG. Nos données montrent que les molécules d'adhésion cellulaire fortement N-glycosylées avec des domaines d'immunoglobuline (IgSF-CAMs) sont hautement sensibles au défaut de N-glycosylation. En utilisant de l'imagerie en temps réel de cellules granulaires en culture, nous avons identifié un défaut d'extension des neurites liée aux IgSF-CAMs. Ce défaut est lié à une altération de la glycosylation et fonctionnement de L1CAM et NrCAM. Nous avons ensuite évalué si le défaut était conservé dans les neurones humains. Pour étudier cette possibilité, nous avons généré des cellules humaines pluripotentes (hiPCS) SRD5A3-/- qui ont été différenciés vers des neurones corticaux. Ces neurones récapitulent le défaut biochimique trouvé chez la souris (hypoglycosylation de NrCAM et L1CAM). Cette découverte étend nos conclusions à l'ensemble du cerveau humain. Enfin, en utilisant la microscopie électronique, nous avons pu identifier une organisation des fibres parallèles cérébelleuses perturbée chez le mutant, en accord avec le rôle établi de nombreuses IgSF-CAM dans le guidage axonal. Nos résultats fournissent des preuves sur le mécanisme impliqué dans la sensibilité spécifique du cervelet à une altération de la N-glycosylation. De plus, nous montrons comment les défauts de la N-glycosylation affectent principalement l'adhésion cellulaire. Notre travail fournit également de nouvelles preuves sur l'importance critique de la N-glycosylation multiple des IgSF-CAM pour leur stabilité et leur fonctionnalité au cours du développement du cerveau des mammifères.Cerebellar defects encompass a group of rare diseases affecting cerebellar functioning. The prevalence of these defects is estimated to be 26 in 10000 children in Europe. These diseases lead to movement disorders (ataxia) and are frequently associated with intellectual disability, life-threatening conditions that help affected patients from coping with a normal daily life. For most of these conditions, only supportive treatment is available. Besides genetic diagnose, helpful when facing new pregnancies, an in-deep understanding of the physiopathology underlying the disorder is necessary for future therapeutics. My thesis project had as objective to improve the genetic diagnose of cerebellar defects and understanding the physiopathology behind one of the more prevalent cause of cerebellar defects: disruption of protein N-glycosylation. Disruption of protein N-glycosylation causes Congenital Disorders of Glycosylation (CDG), multisystemic disorders with severe neurological disorders. Early-onset cerebellar atrophy and hypoplasia are frequently observed, especially in CDG cases with SRD5A3 mutations. To understand how a general N-glycosylation defect affects cerebellar development, we generated a cerebellum-specific Srd5a3 conditional KO mouse. This model recapitulates the human defect with abnormal N-glycosylation, cerebellar hypoplasia and motor coordination impairment. Careful histological evaluation of the cerebellum proved some granule cells to be unable to initiate their final migration during cerebellar development. By combining a proteomic and a glycoproteomic approach, we showed that a defect in N-glycosylation has a variable impact depending on the number of N-glycosylation sites on each protein. The more N-glycosylation sites that a protein has, the more sensitive it is to hypoglycosylation and/or degradation in a CDG context. Our data suggest the heavily N-glycosylated cell adhesion molecules with immunoglobulin domains (IgSF-CAMs) to be highly sensitive to the glycosylation defect. Using in vitro live granule cells imaging, we identified an IgSF-CAM-dependant neurite extension defect. This defect is linked to impaired glycosylation and functioning of L1CAM and NrCAM. We next evaluated if the defect was conserved in human neurons. To investigate that possibility we generated SRD5A3-/- hiPSCs that were further differentiated towards cortical neurons. Human neuron-like cells recapitulate the biochemical defect in mouse (e.g. L1CAM and NrCAM hypoglycosylation). This finding expands our conclusions to the whole human brain. Finally, using electron microscopy we could identify disrupted cerebellar parallel fiber organization in the mouse mutant, consistent with the established role of numerous IgSF-CAMs in axon guidance. Our results provide important evidence into the molecular mechanism underlying cerebellar sensitivity to an N-glycosylation impairment. Moreover, we show how defects in N-glycosylation will primarily affect cell adhesion. Our work also provides new evidence for the critical importance of the multiple N-glycosylation of IgSF-CAMs for their stability and functionality during mammalian brain development