Development and validation of LC/MS method for routine based analysis of protein biomarkers

Depuis quelques années, la spectrométrie de masse est considérée comme la méthode de référence en chimie analytique. La « protéomique », concept qui a émergé dans les années 2000, consiste en l’identification et/ou la quantification d’un ensemble de peptides et protéines présentes dans un échantillon donné (cellules, tissus, ou des prélèvements biologiques), à un instant donné. Un champ plus spécifique de ce concept, la « protéomique clinique » concerne plus particulièrement l’étude du protéome pour la recherche d’une part, de marqueurs diagnostiques, pronostiques et de suivi thérapeutique des pathologies humaines et, d’autre part, d’acteurs physiopathologiques pouvant servir de cible thérapeutique. Actuellement, la technologie de choix utilisée pour l’analyse des protéines en biochimie clinique est le dosage immuno-enzymatique de type ELISA qui possède des inconvénients majeurs : pas ou peu multiplexable, une grande variabilité, pas de standardisation interne et l’incapacité à distinguer des protéoformes d'une même protéine. La protéomique ciblée de type Liquid Chromatography/Multiple Reaction Monitoring (LC-MRM) permet de surpasser ces inconvénients car elle est multiplexable (>200 protéines/expérimentations), robuste, permet l’utilisation de standard protéique/peptidique interne, et permet de distinguer une grande variété de modifications post traductionnelles.Ce projet de thèse consiste donc à évaluer et valider des techniques de spectrométrie de masse ciblées de type LC-MRM pour la quantification de protéines d’intérêt cliniques. Dans ce cadre, nous allons présenter trois développements de méthode de protéomique clinique : le phénotypage de l’Apolipoprotéine E, facteur de risque de la maladie d’Alzheimer ; la quantification sérique d’un anticorps monoclonal thérapeutique (Bevacizumab) avec immuno-enrichissement ; et la quantification absolue de l’hepcidine dans le cadre des pathologies liées au métabolisme du fer.In recent years, mass spectrometry has been considered in the analytical chemistry field as the reference method. "Proteomics", a concept that emerged in the 2000s, consists in the identification and/or quantification of peptides and proteins in different type of samples (cells, tissues, or biological samples), in various conditions. A more specific field of this concept, the "clinical proteomics" specifically concerns the study of proteome for the research on one hand, diagnostic markers, prognostic and therapeutic follow-up of human pathologies and, on the other hand, of pathophysiological actors that can serve as a therapeutic target.Currently, the technology of choice used for the analysis of proteins in clinical biochemistry is the ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) which has major drawbacks: not a multiplex analysis, high variability, no standardization, and the inability to distinguish proteoforms of one protein. The targeted proteomics by Liquid Chromatography/Multiple Reaction Monitoring (LC-MRM) allows to surpass these disadvantages because is highly multiplexable (> 200 proteins/analysis), robust, compatible to the use of protein/peptide standards, and is able to distinguish a wide variety of post translational modifications.In this thesis project, evaluation and validation of the targeted mass spectrometry (LC-MRM) will be perform for the quantification of proteins with clinical interest. In this context, we will present three clinical proteomics developments: apolipoprotein E phenotyping, considered as the best risk factor for Alzheimer's disease; Monoclonal therapeutic antibody (Bevacizumab) quantification in patient serum; and absolute quantification of hepcidin-25 in the context of diseases related to iron metabolism