Investigation of cell penetrating peptide translocation : microfluidic, electrophysiology and force measurements approaches

Faire traverser une membrane cellulaire à des molécules bioactives est un enjeu majeur dans des perspectives thérapeutiques ou de diagnostique. En effet l’activité de nombreuses molécules bioactives, médicaments ou agents de contraste pour l’imagerie médicale, est limitée par leur faible capacité à entrer à l’intérieur des cellules cibles. Une classe de molécules, les "Cell Penetrating Peptides" (CPP), possède la propriété de traverser la membrane cellulaire en entraînant des molécules bioactives liées covalemment ou non. Les CCP permettent ainsi d’améliorer l’efficacité et le ciblage de molécules telles que des acides nucléiques (siRNA ou plasmide), des protéines, des agents de contraste. Cependant le mécanisme moléculaire de la traversée de la membrane par les CPP est encore mal connu. Nous cherchons à obtenir une description détaillée (cinétique et énergétique) des différentes étapes (adhésion/insertion/traversée) de l’interaction des CPP avec la membrane d’une cellule. Dans ce but nous développons une approche originale couplant une mesure de force d’interaction entre les CPP et la membrane via la technique du "Biomembrane Force Probe" et une mesure électrique de type électrophysiologie permettant de déterminer le degré d’insertion des CPP dans la membrane et l’état de cette dernière. En parallèle, nous mettons en place des outils de microfluidique qui nous permettront de tester sur des systèmes modèles l’impact de différents paramètres (nature du lipide, charge, température …) sur la traversée d’une membrane par un CPP. Ce travail est effectué en collaboration avec le Laboratoire des BioMolécules (LBM) et le Laboratoire Interface et Système Electrochimique (LISE).Cell Penetrating Peptides (CPPs) are known to be able to cross cell membranes with a cargo through two different mechanisms: endocytosis and direct translocation. However, the molecular mechanism of the translocation remains unknown. Our objectives are to find the intermediate structures formed by the CPP and the protein, sugar, and lipid partners, to quantify the strength of the interactions and to measure the kinetics of the steps of the interaction of a CPP with a membrane. This is achieved by using two approaches : (i) coupled BioMembrane Force and electrophysiology, (ii) model membrane in inverse emulsions. (i) Biomembrane Force Probe is a technique for measuring the adhesion force between few molecules grafted on a micrometric bead and a target cell or a liposome. This technique has been used to identify partners of CPP at the cell surface. Electrophysiological measurements on the target cell enable to detect a possible perturbation of a membrane interacting with CPPs. (ii) Inverse emulsions are aqueous droplets into oil covered by lipids. At the interface between two adhering droplets a bilayer is formed. We monitor the translocation of fluorescently labeled CPP through this bilayer. The translocation of several CPPs through negatively charged bilayer within tens of minutes has been detected. The nature of the lipids and the asymmetry of the bilayer seem to impact the translocation. We are currently improving the formation of the pairs of droplets with microfluidic devices for statistical analysis