Untersuchung der Funktion von mCAPS2 in der Befüllung und Freisetzung von Katecholaminen in murinen Chromaffinzellen

Dysregulation der Freisetzung der Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin führt zu erhöhtem Blutdruck, zu erhöhter Herzfrequenz, zu Herz- und Gefäßerkrankungen und ist mit Erkrankungen wie Schizophrenie und Autismus assoziiert. Adrenalin und Noradrenalin sind Katecholamine, die in LDCVs (large dense core vesicles) gespeichert werden. Die Calcium-abhängige Exozytose der LDCVs ist stark reguliert und beinhaltet einen Komplex von Proteinen, deren Funktion bereits gut erforscht ist. Eins dieser regulatorischen Proteine ist CAPS (calcium-dependent activator protein for secretion). Ein Doppel-Knockout von CAPS1 und CAPS2 (DKO) führt in Chromaffinzellen zu einer verminderten Exozytose von LDCVs und einer reduzierten Sekretion von Katecholaminen. In dieser Arbeit wurden die Spleißvarianten mCARS2a und mCAPS2b in murinen isolierten DKO-Chromaffinzellen exprimiert, um ihre Funktion in der Beladung der LDCVs mit Katecholaminen sowie Exozytose zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Der einzige Unterschied zwischen mCAPS2a und mCAPS2b besteht darin, dass mCAPS2b das 40 Aminosäuren lange Exons 22 innerhalb der MUN-Domäne enthält. Nach Expression in DKO-Zellen zeigten beide Spleißvarianten eine vergleichbare Fusion von Vesikeln. Die Beladung der LDCVs mit Katecholaminen war jedoch nach mCAPS2b-Expression im Vergleich zu mCAPS2a deutlich höher. Daraus lässt sich schließen, dass CAPS2b das Befüllen von LDCVs fördert. Die Überexpression von mCAPS2b in WT-Zellen hatte weder eine Auswirkung auf die LDCV-Beladung noch auf die Gesamtsekretion. Zusätzlich zum Fülleffekt führte die mCAPS2b-Expression in DKO- und WT-Zellen zu einer verlängerten Sekretionszeit der einzelnen Vesikel, was darauf hindeutet, dass der Fusionsprozess selbst verlangsamt wurde. Eine elektronenmikroskopische Untersuchung zeigte, dass CAPS2b-Expression in DKO-Zellen zu einem verkleinerten LDCV-Radius führte, während die LDCVs in WT- und DKO-Chromaffinzellen gleich groß waren. Das Schrumpfen der Vesikel könnte ein Grund für die beobachtete verlangsamte Fusion der LDCVs sein, erklärt jedoch nicht deren erhöhte Befüllung mit Katecholaminen. Deshalb wurde getestet, ob der Füllungsunterschied auf eine Verschiebung im Protonengradienten der Granulen, der für den Transport der Katecholamine in die LDCVs erforderlich ist, zurückzuführen war. Unter Verwendung eines pH-empfindlichen Fluoreszenzmarkers NPY-ClopHensorN(Q69M), der ins vesikuläre Lumen adressiert wurde, wurde kein Unterschied im luminalen pH von Vesikeln in WT- und DKO-Chromaffinzellen festgestellt. Weitere Untersuchungen mit CHO (chinese hamster ovarian)-Zellen, die den vesikulären Monoamintransporter 1 (VMAT1) exprimierten, zeigten, dass Expression von mCAPS2b, aber nicht von mCAPS2a, die Aufnahme von Monoamine erhöhte. Das belegt, dass mCAPS2b die LDCV-Beladung mit Katecholaminen in Anwesenheit von VMAT1 erhöht. Hierfür wurde die Anwesenheit des Exons 22 in der MUN-Domäne von mCAPS2b verantwortlich gemacht. Um den Mechanismus von mCAPS2b-Exon 22 beim Befüllen der LDCVs besser zu verstehen, wurde unter Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems nach Proteinen gesucht, die mit mCAPS2-Exon 22 interagieren. Das verwendete Screening-System ergab jedoch nur falsch positive Signale, sodass kein direkter Proteininteraktionspartner gefunden wurde. Für zukünftige biochemische Analysen wurde ein Antikörper gegen das Exon 22 hergestellt. Seine Spezifität wurde für mCAPS2b bestätigt und eine endogene Expression von mCAPS2b konnte im Cerebellum postnatal nachgewiesen werden. Mit Hilfe dieses Antikörpers sollte es möglich sein, in Koimmunopräzipitaten Interaktionspartner für mCAPS2b und sein Exon 22 zu identifizieren.Dysregulation of stress hormone release Adrenaline and norepinephrine result in increased blood pressure, increased heart rate, cardiovascular disease, and is associated with conditions such as schizophrenia and autism. Epinephrine and norepinephrine are catecholamines stored in large dense core vesicles (LDCVs). The calcium-dependent exocytosis of LDCVs is highly regulated and involves a complex of proteins whose function is already well understood. One of these regulatory proteins is CAPS (calcium dependent activator protein for secretion). A double knockout of CAPS1 and CAPS2 (DKO) leads to reduced exocytosis of LDCVs and reduced secretion of catecholamines in chromaffin cells. In this work splice variants mCARS2a and mCAPS2b were expressed in isolated murine DKO-chromaffin cells to investigate and compare their function in exocytosis and loading of LDCVs with catecholamines. The difference between mCAPS2a and mCAPS2b is the 40 amino acid long exon 22, which is only present in the MUN domain of mCAPS2b. The results showed that although the fusion of vesicles was similar, the proportion of catecholamine-loaded vesicles was significantly higher after mCAPS2b expression compared to mCAPS2a. It can be concluded that CAPS2b promotes the filling of LDCVs. Overexpression of mCAPS2b in WT cells had neither an effect on LDCV loading nor on total secretion. In addition to the filling effect, mCAPS2b expression in DKO and WT cells leads to a longer secretion time of individual vesicles, suggesting that the fusion process itself has prolonged. Electron microscopy analysis revealed that CAPS2b expression in DKO cells resulted in a reduced LDCV radius, whereas LDCVs in WT and DKO chromaffin cells do not showed any difference. Shrinkage of the vesicles may be an explanation for the observed slowed vesicle fusion, but not for increased catecholamine loading. Therefore, it was tested whether the filling difference was due to a shift in the proton gradient of the granules required for the catecholamine filling. Using a pH-sensitive fluorescent marker NPY-ClopHensorN(Q69M), which was targeted into the vesicular lumen, it was found that there was no difference in the luminal pH of vesicles in WT and DKO chromaffin cells. Further studies with CHO (Chinese hamster ovarian) cells expressing vesicular monoamine transporter 1 (VMAT1) showed that expression of mCAPS2b, but not of mCAPS2a, increased monoamine uptake. This demonstrates that mCAPS2b increases the LDCV loading with catecholamines in the presence of VMAT1. This was attributed to the presence of the exon 22 sequence in the mCAPS2b MUN domain. To better understand the mechanism of mCAPS2b in filling of the LDCVs, we searched for proteins interacting with mCAPS2 exon 22 using the yeast two-hybrid system. However, the used screening system gave false positive signals, so no direct protein interaction partner was found. For future biochemical analysis, an antibody against exon 22 was generated. Its specificity was confirmed for mCAPS2b and an endogenous expression of mCAPS2b could be detected in the cerebellum postnatally. With the help of this antibody, it should be possible to identify interaction partners for mCAPS2b and its exon 22 in co-immunoprecipitates