Entwicklung und Etablierung eines auf sekundären, murinen Osteoblasten und Fibroblasten beruhenden Co-Kultur-Modells zur genomischen Analyse von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren und Evaluierung dieser neuen Methode am Beispiel des Bone Morphogenetic Proteins 7

Die Verletzungen der Kreuzbandstrukturen des Kniegelenkes nehmen eine zentrale Bedeutung in der Orthopädie und Unfallchirurgie ein und weisen aufgrund der hohen Inzidenz eine sozioökonomische Relevanz auf. Eine operative Versorgung der vorderen Kreuzbandruptur wird vor allem bei Instabilitäten des Kniegelenkes durchgeführt, um Folgeschädigungen wie beispielsweise sekundäre Meniskusläsionen oder die Entwicklung einer posttraumatischen Gonarthrose zu vermeiden. Trotz der kontinuierlichen Optimierung der operativen Versorgung nach Ruptur des vorderen Kreuzbandes zeigen sich weiterhin hohe Re-Ruptur-Raten, welche einerseits durch noch unzureichende OP-Techniken und ungenügende Patienten-Compliance und andererseits durch biologisches Transplantatversagen zustande kommen. In diesem Zusammenhang stellen die komplexen biologischen Prozesse (Inflammation, Reparatur, Remodelling) der Knochen-Sehnen-Integration einen wichtigen Forschungsschwerpunkt dar, um die mangelhafte Transplantat-Einheilung zu verstehen und letztendlich die zeitgerechte und stabile ossäre Inkorporation von Sehnen-Transplantaten zu gewährleisten. In diesem Zusammenhang nehmen mit den Osteoblasten und Fibroblasten zwei Zelltypen eine zentrale Rolle im Prozess der ossären Sehnen-Integration und der Bildung extrazellulärer Knochen- und Sehnen-Matrix ein. Dabei legen zahlreiche Studien die Vermutung nahe, dass osteoinduktive Substanzen wie beispielsweise das Bone Morphogenetic Protein-7 (BMP7), welches sich bereits zur Behandlung von aseptischen Pseudarthrosen etabliert hat, die Knochen-Sehnen-Integration positiv beeinflussen. Unklar verbleiben jedoch weiterhin die molekularbiologischen und zellbiologischen Abläufe im Bereich des Knochen-Sehnen-Übergangs und die spezifischen Wirkungsmechanismen besagter osteoinduktiver Proteine. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, ein standardisiertes Co-Kultur-Modell zur Simulation und Erforschung der Interaktion von Osteoblasten und Fibroblasten aufzubauen und damit eine kontrollierte Analyse der spezifischen Effekte einmaliger und multipler Stimulation mit BMP7 auf die Knochen-Sehnen-Einheilung zu ermöglichen. Im Rahmen dieser Studie konnte ein standardisiertes, an Wang et al. (2007) angelehntes in vitro Co-Kultur-Modell, bestehend aus sekundären osteoblastischen und fibroblastischen Zellen muriner Herkunft in einem temporären Zwei-Kammer-Kultivierungs-System, etabliert werden, welches sich durch eine einfache Handhabung auszeichnet und als Hochdurchsatz-Verfahren eingesetzt werden kann. In diesem Modell diente eine Agarose-Trennschicht zur vorübergehenden Separation der zuvor genannten Zellen, wobei die Entfernung der Trennschicht die Interaktion der beteiligten Zelllinien ermöglichte. Beruhend auf diesem Modell wurden die Auswirkungen einer einfachen und einer mehrfachen Stimulation der osteoblastischen und fibroblastischen Zellen mit rekombinantem humanen BMP7 (rhBMP7) untersucht und die Ergebnisse hinsichtlich statistisch signifikanter Veränderungen ausgewertet. Histologisch zeigte sich in dieser Studie einerseits eine dosisabhängige und andererseits eine von der Anzahl der Stimulationen abhängige förderliche Wirkung der rhBMP7-Applikation. Es konnte mikroskopisch nachgewiesen werden, dass durch die rhBMP7-Hinzugabe eine beschleunigte Migration und Proliferation der osteoblastischen und fibroblastischen Zellen in die Interaktions-Zone resultierte. Diese Beobachtungen deckten sich mit den Ergebnissen der in dieser Studie durchgeführten molekularbiologischen Analysen spezifischer Markergene der Osteogenese. Über qRT-PCR konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine rhBMP7-Stimulation eine dosisabhängige Steigerung der Alp1-, Col1a1- und Bglap-Genexpression in den osteoblastischen Zellen im Sinne einer gesteigerten Knochenmatrix-Bildung bewirkte. Eine in der Literatur beschriebene Spp1-Genexpressions-Verstärkung in den osteoblastischen Zellen konnte in dieser Studie nicht nachgewiesen werden. Für die fibroblastischen Zellen zeigte sich durch die rhBMP7-Stimulation eine erhöhte Runx2-, Col1a1-, Alp1-, und Bglap-Genexpression. Diese Resultate legten erstaunlicherweise nahe, dass die fibroblastischen Zellen osteogene Eigenschaften ausbilden beziehungsweise annehmen und damit eine Transdifferenzierung zu funktionsfähigen Osteoblasten durchlaufen. Die in dieser Studie präsentierten Ergebnisse lassen vermuten, dass die Knochen-Sehnen-Integration vor allem dadurch zustande kommt, dass in der Kontaktzone zwischen Sehnen- und Knochengewebe einerseits die Osteoblasten vermehrt Knochenmatrix bilden und andererseits die Fibroblasten zu Osteoblasten transdifferenzieren um Knochenmatrix auszubauen und um das Sehnengewebe dadurch ossär zu integrieren. Da viele der molekularbiologischen und zellbiologischen Abläufe der Knochen-Sehnen-Einheilung noch unklar verbleiben, bedarf es weiterer Untersuchungen zur Generierung eines besseren Verständnis für die Prozesse der ossären Sehnen-Integration und zur Entwicklung von therapeutischen Ansätzen