Unravelling the biotechnological potential of halophyte species from the Algarve coast

This work explored the potential of halophyte plants from the Algarve coast as sources of bioactive compounds with biotechnological applications in the pharmaceutical, food and cosmetic areas. Halophytes are salt-tolerant plants that survive in extreme environments and are equipped with powerful defence mechanisms to manage environmental stress, including the production of bioactive molecules. Despite their enormous potential, halophytes are still quite underexplored regarding their biotechnological applications. This study focused on Frankenia laevis L. (sea-heath), Halopeplis amplexicaulis (Vahl) Ces., Pass. & Gibelli, Juncus acutus L. (spiny rush), J. inflexus L. (wire rush), J. maritimus L. (seaside rush), Limonium algarvense Erben (sea lavender), and Polygonum maritimum L. (sea knotgrass). Methanol and dichloromethane extracts from different plant organs were prepared, evaluated for in vitro antioxidant, antidiabetic, anti-hyperpigmentation and neuroprotective activities, and chemically characterized. Sea lavender and sea knotgrass were selected for their high in vitro antioxidant, neuroprotective, anti-hyperpigmentation and antidiabetic properties, and Juncus species for their in vitro antioxidant and neuroprotective capacities. Sea lavender and sea knotgrass had a high phenolics content, presenting a broad diversity of phenolic acids and flavonoids, respectively. The sea knotgrass had the highest in vitro antioxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, neuroprotective and anti-hyperpigmentation properties, closely followed by the sea lavender. Hence, sea lavender and sea knotgrass were selected for experimental production in a greenhouse using different irrigation salinities; freshwater-irrigated plants had the best growth performance and biological properties. Juncunol, a compound isolated from the spiny rush, had in vitro neuroprotective properties, as well as apoptosis-inducing capacity towards hepatocellular carcinoma cells. In conclusion, the halophytes sea lavender, sea knotgrass and spiny rush can be useful sources of bioactive molecules that can potentially help to prevent oxidative stress-related diseases, delay neurodegeneration and hyperpigmentation. The spiny rush is also a promising source of compounds, namely juncunol, with in vitro antihepatocellular carcinoma activity.Este trabalho teve como objetivo principal explorar o potencial biotecnológico de plantas halófilas do Algarve como fonte de compostos bioativos com aplicação em diferentes indústrias, tais como a alimentar, farmacêutica e cosmética. As plantas halófilas são capazes de tolerar elevadas concentrações de salinidade, e são encontradas em ambientes extremos, como sapais, salinas, dunas e praias, onde se encontram expostas a elevados níveis de radiação ultravioleta e a outros stresses ambientais, tais como secura e alagamento. De forma a minimizar os efeitos do stress ambiental, estas plantas estão equipadas com poderosos mecanismos de defesa que incluem, por exemplo, a produção de diversos compostos bioativos, como os compostos fenólicos, cujas propriedades biológicas lhes conferem variadas aplicações biotecnológicas. De facto, algumas plantas halófilas já foram utilizadas para o desenvolvimento de ingredientes inovadores para a indústria alimentar (por exemplo, Hippophae rhamnoides L., Salicornia sp. e Chenopodium quinoa Willd.), cosmética (particularmente Armeria marítima (Mill.) Willd. e Crithmum maritimum L.) e/ou farmacêutica (como suplementos alimentares, nomeadamente Atriplex halimus L. e C. quinoa). No entanto, tanto as atividades biológicas como o potencial biotecnológico destas plantas continuam pouco explorados. Na região do Algarve (sul de Portugal) existem várias espécies halófilas, mas poucas têm sido estudadas apesar do seu grande potencial comercial. De forma a preencher esta lacuna, este trabalho avaliou várias espécies comuns na costa Algarvia quanto ao seu potencial enquanto fontes de compostos e/ou extratos bioativos com aplicações biotecnológicas nas áreas farmacêutica, cosmética e/ou alimentar. As espécies selecionadas foram a Frankenia laevis L. (urze do mar), Halopeplis amplexicaulis (Vahl) Ces., Pass. & Gibelli, Juncus acutus L. (junco-agudo), J. inflexus L. (junco-curvado ou junco-desmedulado), J. maritimus L. (junco-das-esteiras ou junco-marítimo), Limonium algarvense Erben (ladina), e Polygonum maritimum L. (polígonomarítimo). Para tal, começou-se por preparar extratos de metanol e diclorometano dos diferentes órgãos (sementes, flores, pedúnculos, folhas, e/ou raízes), que foram posteriormente avaliados quanto às suas atividades antioxidante (atividade redutora de radicais e quelante de metais), antidiabética (inibição das enzimas α-glucosidase e α-amilase), anti-hiperpigmentação (inibição da enzima tirosinase) e neuroprotetora (inibição das enzimas acetil- e butirilcolinesterase) in vitro. A ladina e o polígono-marítimo tiveram as mais elevadas atividades antioxidante, neuroprotetora e anti-hiperpigmentação, enquanto que o polígonomarítimo revelou também elevada capacidade antidiabética. Por sua vez, as espécies de Juncus mostraram propriedades antioxidante e neuroprotetora. Estas espécies foram então selecionadas para serem estudas em maior detalhe relativamente às suas propriedades biológicas e à sua composição química, usando diferentes solventes de extração, metodologias e modelos experimentais in vitro. Os extratos metanólicos feitos a partir dos órgãos da ladina foram estudados quanto à sua atividade antioxidante e composição química através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A maior capacidade antioxidante e conteúdo em compostos fenólicos, nomeadamente em catequina e ácido gálico, foi observada nos extratos das flores. Posteriormente, infusões e decocções (formulações normalmente utilizadas em medicina tradicional) das flores foram avaliadas quanto às suas atividades antioxidante, anti-inflamatória e composição química, em comparação com o chá verde, uma vez que este último é conhecido pelas suas propriedades medicinais. A ladina apresentou atividades semelhantes às do chá verde, mas menor toxicidade do que este quando testada em linhas celulares de mamífero. Os principais compostos da ladina, detetados por HPLC, foram os ácidos gálico, salicílico e gentísico. De seguida, foi estudado o potencial antioxidante, neuroprotetor e antidiabético de infusões e decocções obtidas de misturas de flores da ladina e chá verde, em diferentes proporções, para determinar possíveis efeitos sinérgicos ou antagónicos. As infusões e decocções de ambas as espécies tiveram elevada atividade antioxidante, mas a sua combinação aumentou sinergicamente a capacidade de sequestração de radicais •OH e a redução da peroxidação lipídica. Para além disso, extratos da ladina apresentaram maior capacidade de inibição das enzimas acetil- e butirilcolinesterase, comparativamente com o chá verde, e as misturas com o chá verde tiveram efeitos sinérgicos. Por sua vez, o chá verde apresentou maior atividade inibitória da enzima α-glucosidase, mas esta atividade decresceu quando misturado com a ladina. A diversidade de compostos detetados por HPLC aumentou nas misturas, as quais ficaram enriquecidas nos ácidos hidroxibenzóico, cafeíco e siríngico. Devido aos resultados promissores obtidos com os extratos da ladina, foi testado o seu cultivo em estufa sob irrigação com água com diferentes salinidades (água doce e água salina proveniente de uma aquacultura). Avaliou-se a influência da salinidade da água da rega no crescimento das plantas, nas propriedades antioxidantes, composição química e citotoxicidade de extratos preparados a partir da biomassa dos diferentes órgãos da planta. Os resultados foram comparados com os obtidos com extratos de plantas colhidas do meio selvagem, que mostraram ser mais ativas. No entanto, as plantas cultivadas mantiveram elevada atividade antioxidante in vitro, especialmente as irrigadas com água doce, assim como baixa toxicidade contra células de mamífero. A análise por cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massa de ultra-alta resolução (UHRMS/MS), mostrou que as flores possuíam maior diversidade de compostos, e que a sua abundância variou com a salinidade da irrigação. Por exemplo, o teor de apigenina e luteolina aumentou com a salinidade, enquanto que o de miricetina diminuiu. A quercetina foi detetada apenas nas plantas silvestres, enquanto que o eriodictiol foi identificado apenas nas plantas cultivadas. Uma vez que o género Polygonum é tradicionalmente utilizado para o tratamento de doenças relacionadas com a inflamação e diabetes, as propriedades antioxidante, antiinflamatória, antidiabética foram avaliados assim como o seu perfil químico. O extrato metanólico das folhas mostrou a maior capacidade antioxidante, enquanto que o extrato de diclorometano das folhas apresentou maior atividade anti-inflamatória. O extrato de metanol das raízes e das folhas exibiu maior atividade antidiabética. A análise por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS) permitiu identificar os compostos β-sitosterol, estigmasterol, 1-octacosanol e ácido linolénico como os possíveis responsáveis pelas atividades observadas. Em seguida, o potencial neuroprotetor desta espécie foi estudado através da avaliação do efeito protetor in vitro sobre o stress oxidativo induzido e a neuroinflamação, seguido pela determinação da sua composição química por cromatografia líquida de ultra-alta pressão (UHPLC) acoplada a espectrometria de massa (MS/MS). Os extratos metanólicos (raízes e folhas) apresentaram a maior atividade neuroprotetora e anti-inflamatória, assim como de redução da citotoxicidade induzida por peróxido de hidrogénio. O polígono-marítimo foi também estudado quanto às suas propriedades anti-hiperpigmentação. Nesta fase, foram utilizados diferentes solventes e metodologias de extração, para otimizar a extração de compostos fenólicos e flavonoides. O extrato de 100% acetona foi selecionado, e apresentou elevada atividade antioxidante, anti-inflamatória e anti-hiperpigmentação. A análise dos seus constituintes foi realizada por LC-UHRMS, e as moléculas miricitrina, catequina e monogaloilhexose foram as principais detetadas. À semelhança da ladina, o polígono-marítimo também foi produzido em estufa, irrigado com diferentes salinidades e sujeito a três colheitas (em intervalos de 6 semanas). A influência destes fatores no seu crescimento, perfil antioxidante, anti-inflamatório e químico (LC-UHRMS), de extratos preparados a partir da biomassa, foi estudada. Neste caso, os extratos de plantas irrigadas com água doce foram mais ativos que os provenientes de plantas irrigadas com água salgada artificial, especialmente na terceira colheita. Alguns compostos permitiram diferenciar entre salinidades ou colheitas, como o hiperosídeo, cuja concentração aumentou com a salinidade, e os teores de ácido cafeico 3-sulfato que diminuíram da primeira para a segunda e terceira colheitas. O potencial antioxidante e neuroprotetor de extratos de diclorometano e metanol obtidos dos vários órgãos das espécies de Juncus foram também explorados. A espécie junco-agudo apresentou os melhores resultados, particularmente o extrato de diclorometano das folhas. O composto responsável pela atividade foi isolado e identificado por HPLC como sendo o juncunol (um composto derivado do fenantreno). Esta molécula tinha sido previamente isolada das partes aéreas do junco-agudo, tendo revelado uma promissora atividade seletiva e citotóxica contras células de carcinoma hepatocelular. Deste modo, foi feito um estudo preliminar do seu modo de ação em células de hepatocarcinoma humano. Este composto mostrou promover a indução de apoptose, potencialmente relacionada com uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial, assim como interrupção do ciclo celular na fase G0/G1. Considerando as espécies acima mencionadas, tanto a ladina como o polígono-marítimo apresentaram um elevado teor em compostos fenólicos, no entanto, a ladina teve um teor de flavonoides mais elevado. O perfil de fenólicos mostrou elevada prevalência de ácidos fenólicos na ladina e de flavonoides no polígono-marítimo. Os extratos de polígono-marítimo apresentaram a maior capacidade antioxidante, anti-inflamatória, neuroprotetora, antidiabética e anti-hiperpigmentação in vitro. No entanto, a ladina mostrou atividades bastante próximas deste. A molécula juncunol, isolado do junco-agudo, apresentou propriedades neuroprotetoras, assim como capacidade de indução de apoptose e paragem do ciclo celular em células do carcinoma hepatocelular. No geral, tanto a ladina como o polígono-marítimo mostraram ser fontes de ingredientes bioativos que podem ajudar a prevenir doenças relacionadas ao stress oxidativo, hiperpigmentação, diabetes, e distúrbios neurodegenerativos. O junco-agudo tem o potencial de ser usada como fonte de antioxidantes, agentes neuroprotetores e anti-tumorais. Em conclusão, o resultado deste trabalho demonstra que as três espécies de plantas halófilas estudadas são boas candidatas a serem utilizadas para fins comerciais: como bebidas à base de plantas (infusões/decocções da ladina), como fontes de moléculas importantes para a indústria (junco-agudo – juncunol), ou como ingredientes para a indústria cosmética (polígonomarítimo) e farmacêutica (junco-agudo – juncunol, polígono-marítimo e/ou ladina), e ainda como nutracêuticos/suplementos alimentares (junco-agudo, polígono-marítimo e/ou ladina). Adicionalmente, o perfil químico e atividades biológicas podem ajudar a explicar as suas aplicações biotecnológicas.The author acknowledges the Portuguese Foundation for Science and Technology – FCT for funding the PhD scholarship (SFRH/BD/116604/2016). GreenVet (ALG-01-0145-FEDER-028876