In situ and in silico approaches in the use of birds for environmental biomonitoring of genotoxicity in Cerrado agricultural areas

Birds have often played an important role as environmental bioindicators, and different species can be useful due to their bioaccumulating capacity. The micronuclei test is a cytologic technique used for accessing DNA and is a biomarker for damage to DNA. This study analysed the Cerrado avian community, especially the efficiency of the blue-black grassquit (Volatinia jacarina) in response to pesticide contamination in situ on different-sized coffee farms in southeast Brazil, we proposed an in silico approach to build a phylogenetic gene tree based on the COI gene, owing, especially, to compare the species of the birds most related. The specific aims of the work were (a) to feature a set of community of birds of the Cerrado as environmental indicators associated with pesticides uses performing the erythrocytes micronuclei test of the birds; (b) to assess if the micronuclei frequency was related with the trophic guild of the birds; (c) to verify allometric relationships between birds and the MN frequency; (d) to build with bioinformatics tools, a phylogenetic gene tree based on mtDNA with a better way to compare, evolution assumptions. The birds were captured in three group sizes of farms located at Monte Carmelo, Minas Gerais, Brazil. All farms use the same classes of pesticides but with a progressive increase of concentration and frequency of application. Blood samples were collected in all birds collected via the metatarsal vein with a needle and a syringe of appropriate size. After that, one or two drops of blood were smeared on a slide to perform the staining techniques. Eighty-two individuals of 21 bird species belonging to 11 families that were found in all study areas were used to evaluate micronuclei (MN) frequency. Two hundred and fifty-two MN were counted in every area of the study. The MN average count was 3/10,000 erythrocytes, and 17.1% of all bird species exhibited no MN. The average MN was 1.29 ± 0.69 in small farms, 2.59 ± 1.65 in medium farms, and 5.41 ± 1.34 in large farms. Small farms accounted for 14.3% of MN frequency, medium farms 27.8%, and large farms 57.9%. V. jacarina was the most abundant species found and displayed a sensitive response to environmental contamination. Pesticides appear to induce MN formation in a dose-dependent way when farms are analysed according to their area. Therefore, biomonitoring birds remains an efficient means to detect environmental pollutants, especially pesticides. V. jacarina responds as a sensitive biomonitor, showing a dose-dependent response to pesticides used in coffee farms. Due to the high diversity of birds in Brazil, we propose an alternative tool to cluster different species of birds in the same analysis just to help in researches the need of a cheap and fast data collection, as with the case of environmental biomonitoring using the MN test, as the principle technique, being faster and cheaper than possibly before. Therefore, a huge sample effort would violate these principles. V, jacarina was the specie most frequently sampled and showed a sensitive response to environmental contamination. Moreover, birds as biomonitors remain efficient in detection of environmental pollutants, especially pesticides. V. jacarina acted as a sensitive biomonitor, showed a size-dependent response to pesticides used in the coffee farms.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorTese (Doutorado)As aves têm desempenhado um importante papel como bioindicadoras ambientais sendo que diferentes espécies podem ser úteis devido à sua capacidade de bioacumulação. O teste de micronúcleo é uma técnica usada para avaliar a genotoxicidade e a clastogenicidade de diferentes substâncias sendo considerado também um biomarcador de danos ao DNA. O presente estudo analisou a comunidade de aves do Cerrado, especialmente a eficiência do Tiziu (Volatinia jacarina) em responder a contaminação de agrotóxicos in situ, em relação a fazendas de café de diferentes tamanhos, localizadas na região sudeste do Brasil. O estudo propõe também uma abordagem in silico na construção de uma árvore filogenética, baseada no gene COI, visando sobretudo comparar espécies de aves mais próximas na escala evolutiva. Os objetivos específicos do trabalho foram (a) caracterizar uma coorte da comunidade de aves do Cerrado como indicadoras ambientais associada ao uso de agrotóxicos realizando teste de micronúcleos nos eritrócitos periféricos das aves; (b) analisar se a frequência de micronúcleo está relacionada com a guilda alimentar das aves; (c) verificar relações alométricas entre as aves e a frequência de MN; (d) construir com uma ferramenta da bioinformática, uma árvore filogenética baseada no mtDNA como forma de melhor comparar, em termos evolutivos. As aves foram coletadas em fazendas dentro de três grupos (pequenas, médias e grandes) localizadas em Monte Carmelo, Minas Gerais, Brasil. Todas as fazendas utilizam as mesmas classes de agrotóxicos, mas com um progressivo aumento da concentração ou frequência de aplicação. Amostras de sangue foram coletadas de todos os indivíduos registrados através da veia metatarsal com o auxílio de uma agulha e seringa de tamanhos compatíveis. Em seguida, uma ou duas gotas de sangue foram colocadas na lâmina histológica para realizar as técnicas de coloração. Oitenta e dois indivíduos pertencentes a 21 espécies presentes em 11 famílias foram encontradas em todas as áreas de estudo e foram utilizados para avaliar a frequência de micronúcleos (MN). Duzentos e cinquenta e dois MN foram encontrados em nas áreas de estudo. A contagem média de MN foi de 3/10.000 eritrócitos e, 17,1% de todas as aves não exibiram MN. A média de MN foi de 1,29 ± 0,69 nas fazendas pequenas, 2,59 ± 1,65 nas fazendas médias e 5,41 ± 1,34 nas fazendas de grande porte. As fazendas pequenas contabilizaram 14,3% da frequência de MN, as fazendas médias somaram 27,8% e as fazendas de grande porte 57,9% da frequência de MN. As comparações in silico foram realizadas construindo uma árvore filogenética baseada em uma sequência gênica para 20 das 21 espécies amostradas em campo. Sete espécies não apresentaram frequência de MN mas não foi possível descartá-las de serem potenciais biomonitoras. Contrariamente, Leptotila rufaxilla, Volatinia jacarina, Galbula ruficauda, Gnorimopsar chopi, Molothrus bonariensis, Passer domesticus, Turdus leucomelas e Turdus rufiventris exibiram seis ou mais micronúcleos por 10 mil eritrócitos e são, certamente, espécies com alto potencial de uso ao biomonitoramento ambiental. A frequência de MN nos eritrócitos foi positivamente correlacionada com o uso de uma mistura de agrotóxicos de forma tamanho-dependente as fazendas de cafés. Mesmo apresentando uma discreta relação negativa entre a frequência de micronúcleos e os dados morfométricos das aves, especialmente o comprimento do bico, não foi encontrada nenhuma correlação estatisticamente significativa. Devido a alta diversidade de espécies de aves encontradas no Brasil, propõe-se uma ferramenta alternativa para agrupar diferentes espécies na mesma análise apenas para auxiliar nas pesquisas que necessitam de uma coleta de dados rápida e econômica, como é o caso do biomonitoramento ambiental usando o teste de micronúcleos, uma vez que um dos princípios da técnica é de ser justamente rápida, barata e o mais simples possível. Portanto, um grande esforço amostral violaria esses princípios. V. jacarina foi a espécie mais frequentemente encontrada e exibiu uma resposta sensível a contaminação ambiental. Sendo assim, as aves como biomonitoras permanecem eficientes em detectar poluentes ambientais, especialmente agrotóxicos. V. jacarina atuou como um biomonitor sensível exibindo uma resposta área-dependente para os agrotóxicos usados nas fazendas de cafés