O papel dos biofilmes na multirresistência de Klebsiella pneumoniae a antibióticos

Dissertação de mestrado em BiotecnologiaKlebsiella pneumoniae is a multi-drug resistant (MDR) Gram-negative bacterium that has gain importance in the global crisis of antibiotic resistance in comparison with other MDR pathogens due to the emergence of extended-spectrum β-lactamases (ESBL) and carbapenem-resistant K. pneumoniae (CR-KP). The infections caused by ESBL and CR-KP are associated with increased mortality and morbidity rate due to the lack of effective treatments. Biofilm formation exacerbates the antibiotic tolerance of these genetic variants conferring a multifactorial resistance. The objective of this work consisted in the study of the role of biofilms in the K. pneumoniae formed by MDR strains to further determine a possible association between resistance profiles or virulence factors expression with ability to form biofilms and disseminate resistance to other species within biofilms. In this study, 26 K. pneumoniae strains with distinct resistance profiles, including ESBL and CR-KP variants, were used to evaluate the virulence factors expression, biofilm formation ability, clonal diversification and the potential to disseminate antibiotic resistance to P. aeruginosa. Among these determinants, it was found that ESBLs variants had more propensity to form biofilms, which reinforced the role of biofilms in K. pneumoniae resistance. By this reason, biofilm formation was further deeply explored in order to gain insights about its physiology and their role in antibiotic resistance. Therefore, biofilm matrix composition was inferred using two different enzymatic treatments with DNase I and proteinase K and the results revealed that matrix had significant protein content but limited extracellular DNA. The matrix composition did not seem to be correlate with the resistance profile of K. pneumoniae strains. In this study, it was also evaluated the potential of biofilms to provide favorable conditions to the dissemination of resistance to other bacterial species. After 24 and 72h of sharing biofilm environment, P. aeruginosa did not seem to gain additional antibiotic tolerance from K. pneumoniae, even from ESBL-producing strains. Nevertheless, P. aeruginosa enjoyed the mechanisms of resistance of K. pneumoniae in biofilms persisting after aggressive antibiotic treatments. The results of this project allowed to clearly determine that ESBL-producing strains had more ability to form biofilms, highlighting the importance of biofilms. Moreover, the results revealed that matrix played a major role in antibiotic resistance being diminished in favor of cell survival. The matrix also seemed to confer this protection to other bacterial species that lives in K. pneumoniae biofilms. The results of this work will help to design effective antibiotic strategies to control the spread of K. pneumoniae.A Klebsiella pneumoniae é uma bactéria Gram-negativa multirresistente (MDR) que ganhou uma enorme importância nesta crise global de resistência a antibióticos em comparação com outros patogénicos MDR devido ao surgimento de β-lactamases de espectro estendido (ESBL) e carbapenemases (CP-KP). A infeção causada por ESBL e CR-KP está associada a um aumento da taxa de mortalidade e morbidade devido à falta de tratamentos eficazes. A formação de biofilme exacerba a tolerância a antibióticos dessas variantes genéticas, conferindo uma resistência multifatorial. O objetivo deste trabalho consistiu no estudo do papel dos biofilmes em estirpes MDR de K. pneumoniae para determinar uma possível associação entre perfis de resistência ou expressão de fatores de virulência com a capacidade de formação biofilmes e disseminação de resistência a outras espécies dentro dos biofilmes. Neste estudo, 26 estirpes de K. pneumoniae com perfis de resistência bastante distintos, incluindo as variantes ESBL e CR-KP, foram usadas para avaliar a expressão dos fatores de virulência, capacidade de formação de biofilme, diversificação clonal e o potencial de disseminação de resistência a antibióticos para P. aeruginosa. Entre esses determinantes, verificou-se que as variantes de ESBLs tinham mais propensão a formar biofilmes, o que reforça o papel dos biofilmes na resistência da K. pneumoniae. Por esse motivo, a formação de biofilme foi mais profundamente explorada, a fim de obter conhecimento sobre sua fisiologia e seu papel na resistência a antibióticos. Portanto, a composição da matriz de biofilme foi inferida usando dois tratamentos enzimáticos diferentes com DNase I e proteinase K e os resultados revelaram que a matriz apresentava conteúdo proteico significativo, mas DNA extracelular limitado. A composição da matriz não parece estar correlacionada com o perfil de resistência das estirpes de K. pneumoniae. Neste estudo, também foi avaliado o potencial dos biofilmes em proporcionar condições favoráveis à disseminação da resistência a outras espécies bacterianas. Após 24 e 72 h de partilha do ambiente do biofilme, a P. aeruginosa não pareceu adquirir tolerância adicional a antibióticos, mesmo de estirpes de K. pneumoniae produtoras de ESBL. Contudo, a P. aeruginosa desfrutou dos mecanismos de resistência de K. pneumoniae em biofilmes que persistem após tratamentos agressivos com antibióticos. Os resultados deste projeto permitiram determinar claramente que estirpes produtoras de ESBL tinham mais capacidade de formar biofilmes, destacando a sua importância. Além disso, os resultados revelaram que a matriz desempenhou um papel importante na resistência a antibióticos, diminuindo em favor da sobrevivência celular. Essa matriz também parecia conferir essa proteção a outras espécies bacterianas que vivem nos biofilmes de K. pneumoniae. Os resultados deste trabalho ajudarão a elaborar estratégias antibióticas eficazes para controlar a disseminação de K. pneumoniae