Tissue engineering approaches in a musculoskeletal disease scenario

Tese de Doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células EstaminaisMeniscus injuries are among the most frequent orthopedic injuries that can require surgical intervention. Management of meniscus injuries is often challenging and partially unresolved. In this context, tissue engineering strategies are emerging as a reliable solution to repair or regenerate diseased/damaged tissues as it involves the use of cells, scaffolds and bioactive agents, alone or in combination. Given the critical roles of microstructure on the performance of scaffolds, characterization of the micro-structure is indispensable. The acquisition parameters of Micro-computed tomography (micro-CT) are user-dependent, and may have significant effects on the obtained results. Patientspecificity and suturability of the scaffolds are two of the main surgical requirements which are for the dimensional fit of the implant, fixation of the implant, and avoidance of the post-operative extrusion of the implant. In this doctoral work, the scientific and clinical challenges mentioned above were addressed. The 3D cellular density of human meniscus was investigated, and to the best of our knowledge, this is the first study on 3D quantification of the cells in the human meniscus. These valuable insights on the 3D cellularity of the meniscus can support the cell-based strategies. Regarding the micro-CT characterization of the scaffolds, we have showed that the acquisition parameters could statistically significantly affect the quantified micro-structural parameters. This is the only study examining the effects of such a wide range of micro-CT acquisition scenarios on the 3D analysis of scaffolds. Herein, we propose novel Entrapped in Cage (EiC) scaffolds of 3D-printed polycaprolactone (PCL) and porous silk fibroin for meniscus tissue engineering, seeded with human stem cells or human meniscocytes, and characterized in vitro and in vivo. To address the suturability of scaffolds, we proposed a novel suturable regenerated silk fibroin scaffolds reinforced with 3D-printed PCL mesh. Results showed that the suture retention strength increased significantly. The tissue infiltration and formation of new blood vessels were assessed by means of performing an in vivo subcutaneous implantation. To address, the patient-specificity of meniscal scaffolds, we established a reverseengineering method to produce 3D-printed patient-specific meniscal scaffolds using the patients’ knee magnetic resonance imaging (MRI) data. This thesis is a step forward on the research dealing with meniscus tissue engineering, and brings us a step closer to the development of patient-specific meniscal implants and translation of personalized tissue engineering into daily clinical approaches when treatment of meniscus lesions is envisioned.As lesões meniscais são um problema ortopédico frequente, podendo requerer intervenção cirúrgica. No entanto, frequentemente, este desafio clínico apenas é parcialmente resolvido. Neste contexto, as estratégias de engenharia de tecidos (ET) permitem reparar/regenerar tecidos, recorrendo ao uso de células, matrizes tridimensionais (3D) porosas e agentes bioativos, isoladamente ou combinadas. A microestrutura é um parâmetro fundamental na matriz. Os parâmetros de aquisição de microtomografia computadorizada (micro-CT) são dependentes do utilizador, o que pode afetar os resultados obtidos. As necessidades e anatomia dos pacientes e a suturabilidade das matrizes são dois dos principais requisitos cirúrgicos para o adequado ajuste do implante, fixação, e prevenção da sua extrusão. Neste trabalho de doutoramento, os desafios científicos e clínicos mencionados são endereçados. A densidade celular do menisco foi investigada. Com base no estado da arte, este é o primeiro estudo que reporta a quantificação 3D da densidade celular no menisco humano. Esta informação pode suportar estratégias avançadas baseadas em terapias celulares. Considerando a caracterização das matrizes por micro-CT mostrou-se que os parâmetros afetam a quantificação da microestrutura. Este é o único estudo a reportar os efeitos de vários cenários de aquisição de micro-CT na análise de matrizes usadas em ET. Foi também proposto o desenvolvimento de novas matrizes impressas, “Entrapped in Cage” (EiC), obtidas da combinação de policaprolactona (PCL) e fibroína de seda, para abordagens da engenharia de tecidos do menisco, cultivadas com células estaminais humanas ou com meniscócitos humanos, e caracterizadas in vitro e in vivo. Para melhorar a sua suturabilidade, foram desenvolvidas de matrizes de fibroína de seda reforçadas com uma malha impressa de PCL, o que melhorou significativamente a força de retenção da sutura. A infiltração de tecido e a formação de novos vasos sanguíneos in vivo foram avaliadas subcutaneamente. Para a personalização dos implantes, foi desenvolvido um método de produção matrizes por engenharia reversa, recorrendo à impressão 3D e à imagiologia de ressonância magnética (IRM) do joelho do paciente. Esta tese constitui assim um avanço no desenvolvimento efetivo de implantes/dispositivos médicos personalizados para aplicação na regeneração do menisco, contribuindo ultimamente para a tradução mais rápida das abordagens da ET para a prática clínica quando o tratamento de lesões do menisco são necessárias.The works performed on the scope of this thesis received funding from FP7 Marie Curie Initial Training Network "MultiScaleHuman: Multiscale Biological Modalities for Physiological Human Articulation" (Contract number MRTN-CT-2011-289897), and Ph.D. scholarship (SFRH/BD/99555/2014) from the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT)