Determining the impact of dendritic cells in T-cell leukemia/lymphoma

T-cell acute lymphoblastic leukemia and lymphoblastic lymphoma, are malignancies originating from T-cell precursor, which undergo a developmental arrest at variable stages of maturation. These diseases originate in the thymus, and then spread throughout the body, being fatal without proper and attempted treatment. Microenvironmental cells can support both the initiation, and progression of disease. This microenvironment is composed several cells, including thymic epithelial cells, fibroblasts, macrophages and dendritic cells (DCs). Study of a mouse model of T-cell leukemia/lymphoma revealed significant alterations in thymic stromal cell composition, including an increase of in DCs. Based on this evidence, the present work aimed to identify which DCs, and in what proportion, are increased in leukemic TEL-JAK2 transgenic mice. Moreover, we aimed to assess the possible impact of a specific DC subset, namely the resident DCs, in the leukemia/lymphoma development, by crossing TEL-JAK2 transgenic mice, with Batf3 knockout, which lack resident CD8α+ DCs. A significant increase in the total DC population of the thymus was observed in leukemic mice, although the specific subsets of DCs analyzed, namely plamacytoid and conventional DCs, along with resident and migratory conventional DCs, did not demonstrate significant alterations. TEL-JAK2 transgenic Batf3 knockout mice did not differ from Batf3 heterozygous littermates, regarding the age of leukemia onset (median survival of 11.75 and 11.5 weeks, respectively) and lymphoid and non-lymphoid organ weight. Leukemia cell invasion analysis showed that the Batf3 knockout transgenic mice had a higher level of organ invasion than heterozygous littermates, which might indicate that the absence of CD8α+ DCs attenuates the invasion potential of the leukemic cells. Our work provides evidence that DCs proportions are increased in the thymus of leukemic mice, and that CD8α+ DCs specifically might probably have a role in control of leukemic cells propagation throughout the body.As leucemias e linfomas fazem parte de um grupo de doenças definidos como neoplasias hematológicas. Estas podem ser classificadas de acordo com a linhagem celular afetada, bem como com as características morfológicas, clínicas, imunofenotípicas e genéticas. Assim, de acordo com a linhagem celular, podem ser classificadas em neoplasias mielóides e neoplasias linfóides, sendo que estas podem ainda ser classificados em diferentes subtipos, de acordo com as características mencionadas anteriormente. Leucemias agudas, que afetam principalmente crianças e jovens, representam um terço dos casos de cancro pediátricos diagnosticados. A leucemia linfoblástica aguda é uma enfermidade que envolve progenitores da linhagem linf+oide. Entre as causas externas que originam essa doença, realça-se a radiação ionizante, numa pequena percentagem de casos. Relativamente às causas internas, estas incluem mutações genéticas nos progenitores hematopoiéticos que originam as células T e B, sendo que estas mutações culminam em alterações celulares, incluindo a imortalização das células, aumento da capacidade proliferativa e migração, conferindo propriedades malignas às mesmas. A leucemia linfoblástica aguda das células T (LLA-T), que é um subtipo de LLA, é uma doença com origem nos percursores das células T, células estas que passam por um processo patogénico que culmina na proliferação descontrolada e expansão de células T imaturas. Acredita-se que essa doença tem origem no timo, sendo que as células leucémicas têm a capacidade de migrar para outras partes do corpo. Este subtipo de leucemia representa cerca de 12 a 15% dos casos diagnosticado de LLA-T pediátrico, sendo que os tratamentos atuais conferem uma sobrevivência a longo prazo a cerca de 90% destes pacientes. No entanto, apenas 50% dos casos diagnosticados em adultos seguem esse padrão. Uma das características clínicas desta patologia é o aumento do número de leucócitos no sangue, característica essa a principal causadora dos sintomas frequentemente apresentados pelos pacientes, que incluem náuseas, dor de cabeça, palidez, febre, dificuldades respiratórias e até mesmo anomalias neurológicas. Entre as alterações moleculares ocorrentes na LLA-T, as translocações cromossómicas e mutações pontuais são as mais comuns, envolvendo múltiplos genes, características que conferem a heterogeneidade observada nesta patologia. Para além de alterações genéticas e moleculares, a células leucémicas ainda tiram proveito das células ao seu redor, células estas que formam o microambiente. O microambiente tímico em particular é constituído por várias células que incluem células epiteliais tímicas, macrófagos, fibroblastos e células dendríticas. Com o objetivo de perceber como estas células influenciam a leucemia, diversos estudos têm sido realizados para tal propósito. Estes demonstram a relevância das células do microambiente, e seus respetivos sinais, na transformação maligna, proliferação das células leucémicas, bem como a disseminação da doença pelo corpo. Assim, do conhecimento dos mecanismos envolvidos nestas interações é crucial para a compreensão da doença, bem como para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Das células do microambiente mencionadas anteriormente, ressaltamos as células dendríticas (DCs), que têm origem hematopoiética. Existem diversos tipos de DCs, sendo que as presentes no timo são classificadas em dois grupos principais: plasmacitóide (pDCs) e convencionais (cDCs). Estas últimas são ainda classificadas em residentes e migratórias. Entre as diferenças na expressão de marcadores de superfície que permitem distinguir os diferentes tipos de DCs, as residentes ainda possuem uma particularidade: são o único subtipo de DCs que sofre o processo de maturação no timo, em paralelo com as células T. Este subtipo de DCs é caracterizado pela expressão superficial de CD8α+, molécula que permite distingui-la dos outros subtipos presentes no timo. Com o objetivo de identificar possíveis alterações relativas ao microambiente tímico, o grupo do Doutor Nuno R. dos Santos realizou um estudo, baseado em imunofluorescênia e expressão génica, verificando que a composição do estroma tímico num modelo de leucemia/linfoma de células T (TEL-JAK2) encontra-se alterado. Mais especificamente, este estudo demonstrou que, enquanto as células epiteliais do córtex diminuem a sua proporção, este mesmo tipo celular presente na medula, juntamente com as células dendríticas, estão aumentadas. Com base nestas observações, este projeto teve como principais objetivos: 1) verificar que tipos de células dendríticas, e em que proporções estão presentes e, eventualmente, aumentadas nos linfomas tímicos do modelo transgénico TEL-JAK2; 2) Verificar o efeito da eliminação do fator de transcrição essencial para as células dendríticas residentes (CD8α+) no desenvolvimento da leucemia T. Com vista a alcançar os objetivos propostos, o modelo transgénico TEL-JAK2 foi cruzado com uma estirpe mutante para o gene Batf3. Este gene está altamente expresso nas células dendríticas residentes, e está descrito que a sua ausência resulta na eliminação destas células nos órgãos linfáticos, nomeadamente timo, baço e nódulos. Os murganhos resultantes deste cruzamento foram monitorizados para detetar sinais de doença e, quando estes sinais fossem proeminentes, os mesmos foram eutanasiados, e os órgãos e sangue foram recolhidos para análise posterior. Análises por citometria de fluxo revelaram um aumento significativo de DCs no timo de murganhos transgénicos doentes. No entanto, quando os subtipos destas células foram analisados individualmente, não se identificou alterações relativamente às suas proporções. Estas análises revelaram ainda que os murganhos knockout para Batf3 têm a proporção de DCs CD8α+ severamente reduzidas tanto no timo como no baço, mas não eliminadas por completo. Os nossos resultados demonstraram que a diminuição significativa das DCs CD8α+ não influencia o desenvolvimento da leucemia, sendo que os murganhos TEL-JAK2 com os dois genótipos Batf3 analisados (TEL-JAK2xBatf3+/- e TEL-JAK2xBatf3-/-) apresentaram medianas de sobrevivência semelhantes. A análise de marcadores de células no timo por imunofluorescência revelaram uma alteração quanto à estrutura deste órgão, bem como na distribuição das DCs no mesmo. No entanto, a diminuição das DCs CD8α+ não aparece influenciar estas alterações. Por outro lado, os murganhos knockout para Batf3 aparentam ter um aumento de leucócitos circulantes no sangue. Além disso, apesar de não haver diferenças significativas no peso dos órgãos analisados, análise histológica revelou uma invasão por células leucémicas mais acentuada nos animais Batf3 knockout. Assim, os resultados deste projeto revelam um possível envolvimento das DCs residentes na migração das células leucémicas para a corrente sanguínea e, posteriormente, invasão dos órgãos periféricos, sem, no entanto, afetar a idade de manifestação e severidade da doença