Clonage du gène de la chitosanase de l'actinomycète : kitasatosporia sp. N174

Bien que quelques chitosanases ont déja été caractérisées au point de vue biochimique, la littérature ne rapporte pas encore le clonage d'un tel gène. L'objectif de ce travail consiste donc en le clonage d'un gène de chitosanase provenant de l'actinomycète isolé du sol, Kitasatosporia sp.. Ainsi, l'ADN génomique de Kitasatosporia sp. a été isolé puis digéré totalement par l'enzyme de restriction BglII. Les fragments résultants ont par la suite été ligués au vecteur pIJ702 préalablement clivé au niveau du site unique BglII, puis déphosphorylé. Ce mélange de ligation a été transformé dans des protoplastes de Streptomyces lividans souche TK24 et les recombinants ont été répliqués sur un milieu contenant du chitosane. Sur environ 12 500 colonies, deux démontraient un phénotype de dégradation. Ces deux clones ont été nommés pDF22 et pDF45. Leur ADN plasmidique respectif a donc été isolé puis retransformé pour bien confirmer le phénotype observé. Le fragment contenu dans pIJ702 a ensuite été transféré dans le plasmide pUC118 de Escherichia coli grâce à une digestion avec l'enzyme de restriction BglII, afin de pouvoir effectuer la carte de restriction. Il s'avère que pDF22 contient un insert de 6.5 Kb et que celui de pDF45 mesure 8.1 Kb car il contient un fragment BglII de 1.6 Kb additionnel. Grâce à un gel de polyacrylamide-SDS, on estime le poids moléculaire de la protéine produite à environ 29.5 Kilodaltons ce qui laisserait présager un gène d'une longueur de 0.8 à 1.0 Kb. Ainsi, afin de localiser le gène sur le fragment obtenu, ce dernier a été sous-cloné dans le vecteur-navette pFD666 où plusieurs dérivés de délétion ont été construits. Jusqu'à présent, le plus petit insert produisant l'enzyme est un fragment PstI de 2.7 Kb contenu dans le plasmide pDF226. Le gène se situerait vraisemblablement autour du site unique SphI puisque si ce dernier est clivé, l'expression du gène est interrompu. Ce fragment de 2.7 kb a également été sous-cloné dans le vecteur pIJ2925 d'E. coli afin de procéder à son séquençage